PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum
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トマト遺伝子導入実験プロトコール
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2005. 6/27 改正版 |
形質転換スケジュール
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実験プロトコール
滅菌
700 mg/300 粒
70 % EtOH 2 分振とう
1 % 次亜塩+ 200 μl/L tween 10 分振とう
洗浄
クリーンベンチ作業
洗浄前
SDWで 1 分間× 5 回洗浄
洗浄後
- point
- 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。
播種
クリーンベンチ作業
1/2 MS+3 % Suc+ 0.8 % Agar pH 5.8 25 ℃, 16 h 日長で培養
50-60 粒/7 cm
マヨネーズ瓶
50 粒播種するとこんな感じ
→約 1 週間培養
前培養
クリーンベンチ作業
 胚軸は下の方を使う 子葉の両端を切る |
→湿らしたろ紙へ一時置き→ |  48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ） パラフィルムでシール → 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養 |
- point
- 本葉が出たものはNG。
- 作業中乾かないように注意!!
- 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。
アグロバクテリウムの調整
- 前培養；
- LBプレート（+抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
- ↓2 日間 28 ℃,暗所
- 感染用培養；
- シングルコロニーをLBプレート（+抗生物質）にストリーク
- ↓2 日間 28 ℃,暗所
- point
- 必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する。
- 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。
感染
- 注）改善の余地あり
菌液の準備；
MS液体培地 50 ml +アセトシリンゴン(10 mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング
切片を滅菌した茶漉しに入れ
菌液内で 1 分間攪拌
滅菌したキムタオルで
水分除去
さらに水分除去
元の培地に
（3 日間, 21 ℃,遮光）
除菌
- 注）改善の余地あり
- 洗浄：MS液体培地
- 除菌：MS液体培地+Cb 500 mg/l
2,3 分ゆすりながら洗う
洗浄 1 回/除菌 1 回水分除去→選抜へ
(2 週間, 25 ℃, 16 h 日長)
- point
- 傷をつけないように気をつける。
選抜
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馴化
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→ |  |
- point
- 根を傷つけない
- ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
- 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
- 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。
効率
- 植物形質転換用バイナリーベクター
- Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
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- point
- カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
- Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
- Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens
