PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum

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トマト遺伝子導入実験プロトコール

Horticulture-Solanum-lycopersicum-001.png

2005. 6/27 改正版

形質転換スケジュール

Horticulture-Solanum-lycopersicum-002.png

実験プロトコール

滅菌

洗浄

クリーンベンチ作業

point
  • 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。

播種

クリーンベンチ作業

前培養

クリーンベンチ作業

作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように
胚軸は下の方を使う
子葉の両端を切る
→湿らしたろ紙へ一時置き→
MS+ 2 mg/l Zeatin+ 3 % Suc+0.8 % Agar
48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ)
パラフィルムでシール
→ 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養
point
  • 本葉が出たものはNG。
  • 作業中乾かないように注意!!
  • 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。

アグロバクテリウムの調整

 前培養;
 LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
 ↓2 日間 28 ℃,暗所
 
 感染用培養;
 シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
 ↓2 日間 28 ℃,暗所
 
point
  • 必ず増殖中(盛り上がる前)の菌プレートを用意する。
  • 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。

感染

注)改善の余地あり

除菌

注)改善の余地あり
 洗浄:MS液体培地
 除菌:MS液体培地+Cb 500 mg/l
point
  • 傷をつけないように気をつける。

選抜

Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png
選抜1,2回目(カルス誘導)
カルス誘導培地:MS+ 2 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+0.8 % Agar
point
  • サージカルテープでシール(選抜 1)。
  • パラフィルムでシール(選抜 2)。
  • 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
選抜3回目(再分化誘導)
再分化誘導培地 MS+ 1 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar
point
  • パラフィルムでシール。
  • 1シャーレあたり 20切片以下。
  • 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
Horticulture-Solanum-lycopersicum-019.png  
選抜4回目(シュート伸長・発根)
シュート伸長・発根誘導培地:MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
 
Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png  
選抜5回目(発根)
発根誘導培地:MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
point
  • シュートの条件:発根したカルスから取る。大きさ( 2cm程度。
  • 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。
  • アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。
  • 花芽は切り落とす!!

馴化

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point
  • 根を傷つけない
  • ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
  • 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
  • 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。

効率

植物形質転換用バイナリーベクター
Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
Horticulture-Solanum-lycopersicum-022.png
(平均インサート長:80 Kb)
1ベクターあたり
 感染:240 切片
 馴化できた系統数: 0-21 系統作出
point
  • カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens
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