PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum

トマト遺伝子導入実験プロトコール

200px

2005.6/27改正版

形質転換スケジュール

200px

月曜日 　シングルコロニーの培養 　除菌・選抜（1回目） 　↓ 　水曜日 　トマト播種 　トマト前培養 　感染用アグロの培養 　↓ 　金曜日 　感染 　↓ 　以降2週間おきに選抜

実験プロトコール

滅菌

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 031.jpg

  700mg/300粒

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 032.jpg

  70%EtOH 2分振とう

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 033.jpg
• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 034.jpg

  1%次亜塩+200μl/L tween 10分振とう

洗浄

クリーンベンチ作業

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 041.jpg

  洗浄前

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 042.jpg

  SDWで1分間×5回洗浄

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 043.jpg

  洗浄後

point

• 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。

播種

クリーンベンチ作業

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 051.jpg

  1/2MS+3%Suc+0.8%Agar pH5.8 25℃,16h日長で培養]

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 052.jpg

  50-60粒/7cm
  マヨネーズ瓶

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 053.jpg

  50粒播種するとこんな感じ
  →約1週間培養

前培養

クリーンベンチ作業

File:トマト遺伝子導入実験プロトコール img 061.jpg 作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように 胚軸は下の方を使う 子葉の両端を切る

→湿らしたろ紙へ一時置き→

File:トマト遺伝子導入実験プロトコール img 062.jpg MS+2mg/l Zeatin+3%Suc+0.8%Agar 48切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ） パラフィルムでシール →2日間,25℃,16h日長で培養

point

• 本葉が出たものはNG。
• 作業中乾かないように注意！
• 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。

アグロバクテリウムの調整

　前培養；

　LBプレート（+抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク

　↓2日間 28℃,暗所

　

　感染用培養；

　シングルコロニーをLBプレート（+抗生物質）にストリーク

　↓2日間 28℃,暗所

　

point

• 必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する。
• 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。

感染

注）改善の余地あり

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 081.jpg

  菌液の準備；
  MS液体培地50ml+アセトシリンゴン(10mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 082.jpg

  切片を滅菌した茶漉しに入れ
  菌液内で1分間攪拌

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 083.jpg

  滅菌したキムタオルで
  水分除去

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 084.jpg

  さらに水分除去

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 085.jpg

  元の培地に
  （3日間,21℃,遮光）

除菌

　洗浄：MS液体培地

　除菌：MS液体培地+Cb500mg/l

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 091.jpg

  2,3分ゆすりながら洗う
  洗浄1回/除菌1回

• トマト遺伝子導入実験プロトコール img 092.jpg

  水分除去→選抜へ
  (2週間,25℃,16h日)

point

• 傷をつけないように気をつける