PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum
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トマト遺伝子導入実験プロトコール
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2005.6/27改正版
形質転換スケジュール
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滅菌
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洗浄
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播種
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前培養
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前培養；LBプレート（ +抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
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感染用培養；シングルコロニーを LBプレート（+抗生物質）にストリーク
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・必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する
（導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備
と良い）
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_15.jpg注）改善の余地あり
菌液の準備
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_img_17.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_18.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プ
ロトコール_img_19.jpg
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_20.jpg滅菌したキムタオルで 水分除去
MS液体培地 50ml＋アセトシリンゴン（ 10mg/L)
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_img_22.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_23.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プ
ロトコール_img_24.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_25.jpg
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_26.jpg注）改善の余地あり
洗浄 MS液体培地除菌 MS液体培地+Cb 500mg/l
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2週間,25℃16h日長
傷をつけないように気をつける
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カルス誘導培地 MS+2mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
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サージカルテープでシール（選抜 1）パラフィルムでシール（選抜 2） 24切片/1シャーレ子葉は表
面を上に・少し培地に埋め込む
選抜3回目（再分化誘導）
再分化誘導培地 MS+1mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
パラフィルムでシール 1シャーレあたり 20切片以下 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り
落とす
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シュート伸長、発根誘導培地 MS+1mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
選抜5回目（発根）
発根誘導培地 MS+0.5mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
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シュートの条件：発根したカルスから取る・大きさ（ 2cm程度）発根を阻害されるのでカルスはきれ
いに取り除くアグロとエスケープを防ぐため、少なくとも 3回は頂芽を植継ぐ花芽は切り落とす !!
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- ・
- 根を傷つけない
- ・
- ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1週間程度かけてサランラップをあ
けて湿度を下げていく。
- images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_37.jpg・土でも馴化できるが、湿度には十分注意
する。
- ・水やりは最初の
- 2週間は水のみ、その後 1000倍ハイポネックッス /週1
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h1. 植物形質転換用バイナリーベクター
Liu et al. _Proc. Natl. Acad. Sci. USA. _96, 6535–6540, (1999)
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_39.jpg*(*平均インサート長： *80Kb)*
1ベクターあたり感染：240切片馴化できた系統数： 0～21系統作出
カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります !!
- Yoichi Ogawa · Masahiro Mii *(2004) _Arch Microbiol _181 : 331.336
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Screening for highly active ˟-lactam antibiotics against _Agrobacterium tumefaciens _
