PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_0.jpg
2005.6/27改正版
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_1.jpg
以降2週間おきに選抜
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_2.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_3.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_4.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_5.jpg
本葉が出たものは NG
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_6.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_7.jpg
作業中乾かないように注意!! 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_8.jpg 湿らした ろ紙へ
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_9.jpg
1cm
一時置き
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_10.jpg
作業は湿らせたろ紙の上で~MS+2mg/l Zeatin+3% Suc+0.8% Agar ~
^子葉を傷つけないように^48切片/1シャーレ（ 9cm深底シャーレ）^胚軸は下の方を使う^パラフィルムでシール ^子葉の両端を切る ^2日間 25℃,16h日長で培養
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_11.jpg
前培養；LBプレート（ +抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_12.jpg
感染用培養；シングルコロニーを LBプレート（+抗生物質）にストリーク
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_13.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_14.jpg
・必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する
（導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い）
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_15.jpg
注）改善の余地あり
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_16.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_17.jpg
滅菌したキムタオルで 水分除去
MS液体培地 50ml＋アセトシリンゴン（ 10mg/L)
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_18.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_19.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_20.jpg
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_21.jpg 注）改善の余地あり
洗浄 MS液体培地除菌 MS液体培地+Cb 500mg/l
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_22.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_23.jpg
2週間,25℃16h日長
傷をつけないように気をつける
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_24.jpg
カルス誘導培地 MS+2mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_25.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_26.jpg
サージカルテープでシール（選抜 1）パラフィルムでシール（選抜 2） 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に・少し培地に埋め込む
選抜3回目（再分化誘導）
再分化誘導培地 MS+1mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
パラフィルムでシール 1シャーレあたり 20切片以下 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_27.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_28.jpg images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_29.jpg
シュート伸長、発根誘導培地 MS+1mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
選抜5回目（発根）
発根誘導培地 MS+0.5mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_30.jpg
シュートの条件：発根したカルスから取る・大きさ（ 2cm程度）発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除くアグロとエスケープを防ぐため、少なくとも 3回は頂芽を植継ぐ花芽は切り落とす !!
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_31.jpg
- ・
- 根を傷つけない
- ・
- ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
- images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_32.jpg ・土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
- ・水やりは最初の
- 2週間は水のみ、その後 1000倍ハイポネックッス /週1
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_33.jpg
h1. 植物形質転換用バイナリーベクター
Liu et al. _Proc. Natl. Acad. Sci. USA. _96, 6535?6540, (1999)
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_34.jpg *(*平均インサート長： *80Kb)*
1ベクターあたり感染：240切片馴化できた系統数： 0～21系統作出
カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります !!
- Yoichi Ogawa ・ Masahiro Mii *(2004) _Arch Microbiol _181 : 331.336
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_35.jpg
Screening for highly active ?-lactam antibiotics against _Agrobacterium tumefaciens _
