2005.6/27改正版

以降2週間おきに選抜

本葉が出たものは NG

作業中乾かないように注意!! 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床

<IMG width=303 height=317 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:-19px; margin-left:315px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_8.jpg"> 湿らしたろ紙へ

1cm

一時置き

作業は湿らせたろ紙の上で_{MS+2mg/l Zeatin+3% Suc+0.8% Agar}

^{子葉を傷つけないように}48切片/1シャーレ（ 9cm深底シャーレ）^{胚軸は下の方を使う}パラフィルムでシール ^{子葉の両端を切る}2日間 25℃,16h日長で培養

前培養；LBプレート（ +抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク

感染用培養；シングルコロニーを LBプレート（+抗生物質）にストリーク

・必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する

（導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い）

<IMG width=121 height=79 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:30px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_15.jpg"> 注）改善の余地あり

菌液の準備

<IMG width=68 height=151 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:-5px; margin-left:77px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_20.jpg"> 滅菌したキムタオルで水分除去

MS液体培地 50ml＋アセトシリンゴン（ 10mg/L)

<IMG width=121 height=80 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:54px; margin-left:394px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_26.jpg"> 注）改善の余地あり

洗浄 MS液体培地除菌 MS液体培地+Cb 500mg/l

2週間,25℃16h日長

傷をつけないように気をつける

カルス誘導培地 MS+2mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar

サージカルテープでシール（選抜 1）パラフィルムでシール（選抜 2） 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に・少し培地に埋め込む

選抜3回目（再分化誘導）

再分化誘導培地 MS+1mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar

パラフィルムでシール 1シャーレあたり 20切片以下 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす

シュート伸長、発根誘導培地 MS+1mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar

カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す

選抜5回目（発根）

発根誘導培地 MS+0.5mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar

シュートの条件：発根したカルスから取る・大きさ（ 2cm程度）発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除くアグロとエスケープを防ぐため、少なくとも 3回は頂芽を植継ぐ花芽は切り落とす !!

・</DT>

根を傷つけない</DD>

・</DT>

ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。 </DD>

<IMG width=123 height=56 style="vertical-align:text-bottom; text-align:left; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_37.jpg"> ・土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。</DD>

・水やりは最初の</DT>

2週間は水のみ、その後 1000倍ハイポネックッス /週1 </DD>

植物形質転換用バイナリーベクター

Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6535?6540, (1999)

<IMG width=359 height=92 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:77px; margin-left:389px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_39.jpg"> (平均インサート長： 80Kb)

1ベクターあたり感染：240切片馴化できた系統数： 0～21系統作出

カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります !!

Yoichi Ogawa ・ Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol 181 : 331.336

Screening for highly active ?-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens

</BODY>

PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum

植物形質転換用バイナリーベクター

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