PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum
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Revision as of 18:31, 1 July 2011
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2005.6/27改正版
<IMG width=913 height=605 style="display:block; float:none; margin-bottom:58px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_1.jpg">
以降2週間おきに選抜
<IMG width=903 height=719 style="display:block; float:none; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_2.jpg"> <IMG width=939 height=699 style="display:block; float:none; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_3.jpg"> <IMG width=941 height=704 style="display:block; float:none; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_4.jpg"> <IMG width=124 height=56 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_5.jpg">
本葉が出たものは NG
<IMG width=531 height=127 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:86px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_6.jpg"> <IMG width=303 height=289 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:29px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_7.jpg">
作業中乾かないように注意!! 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床
<IMG width=303 height=317 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:-19px; margin-left:315px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_8.jpg"> 湿らした ろ紙へ
<IMG width=61 height=20 style="display:block; float:none; margin-bottom:18px; margin-right:398px; margin-left:480px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_9.jpg">
1cm
一時置き
<IMG width=124 height=55 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:4px; margin-right:814px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_10.jpg">
作業は湿らせたろ紙の上でMS+2mg/l Zeatin+3% Suc+0.8% Agar
子葉を傷つけないように48切片/1シャーレ( 9cm深底シャーレ)胚軸は下の方を使うパラフィルムでシール 子葉の両端を切る 2日間 25℃,16h日長で培養
<IMG width=547 height=80 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:48px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_11.jpg">
前培養;LBプレート( +抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
<IMG width=289 height=59 style="display:block; float:none; text-align:right" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_12.jpg">
感染用培養;シングルコロニーを LBプレート(+抗生物質)にストリーク
<IMG width=289 height=57 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:5px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_13.jpg"> <IMG width=124 height=56 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:0px; margin-right:705px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_14.jpg">
・必ず増殖中(盛り上がる前)の菌プレートを用意する
(導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い)
<IMG width=121 height=79 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:30px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_15.jpg"> 注)改善の余地あり
菌液の準備
<IMG width=53 height=20 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:157px; margin-right:255px; margin-left:629px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_16.jpg"> <IMG width=100 height=56 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:157px; margin-right:625px; margin-left:212px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_17.jpg"> <IMG width=444 height=320 style="display:block; float:none; margin-bottom:157px; margin-right:245px; margin-left:249px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_18.jpg"> <IMG width=220 height=207 style="display:block; float:none; margin-bottom:157px; margin-right:357px; margin-left:361px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_19.jpg">
<IMG width=68 height=151 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:-5px; margin-left:77px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_20.jpg"> 滅菌したキムタオルで 水分除去
MS液体培地 50ml+アセトシリンゴン( 10mg/L)
<IMG width=220 height=209 style="display:block; float:none; margin-bottom:157px; margin-right:349px; margin-left:369px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_21.jpg"> <IMG width=21 height=49 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:157px; margin-right:122px; margin-left:794px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_22.jpg"> <IMG width=151 height=312 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:157px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_23.jpg"> <IMG width=189 height=216 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:115px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_24.jpg"> <IMG width=940 height=220 style="display:block; float:none; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_25.jpg">
<IMG width=121 height=80 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:54px; margin-left:394px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_26.jpg"> 注)改善の余地あり
洗浄 MS液体培地除菌 MS液体培地+Cb 500mg/l
<IMG width=571 height=403 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:25px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_27.jpg"> <IMG width=191 height=57 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:13px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_28.jpg">
2週間,25℃16h日長
傷をつけないように気をつける
<IMG width=524 height=157 style="display:block; float:none; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_29.jpg">
カルス誘導培地 MS+2mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
<IMG width=205 height=195 style="display:block; float:none; text-align:left" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_30.jpg"> <IMG width=124 height=56 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_31.jpg">
サージカルテープでシール(選抜 1)パラフィルムでシール(選抜 2) 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に・少し培地に埋め込む
選抜3回目(再分化誘導)
再分化誘導培地 MS+1mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
パラフィルムでシール 1シャーレあたり 20切片以下 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす
<IMG width=124 height=56 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:0px; margin-right:180px; margin-left:420px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_32.jpg"> <IMG width=197 height=571 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:14px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_33.jpg"> <IMG width=568 height=157 style="display:block; float:none; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_34.jpg">
シュート伸長、発根誘導培地 MS+1mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
選抜5回目(発根)
発根誘導培地 MS+0.5mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
<IMG width=124 height=49 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:-4px; margin-right:572px; margin-left:28px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_35.jpg">
シュートの条件:発根したカルスから取る・大きさ( 2cm程度)発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除くアグロとエスケープを防ぐため、少なくとも 3回は頂芽を植継ぐ花芽は切り落とす !!
<IMG width=775 height=480 style="display:block; float:none; margin-bottom:34px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_36.jpg">
- ・</DT>
- 根を傷つけない</DD>
- ・</DT>
-
ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、
1週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
</DD>
- <IMG width=123 height=56 style="vertical-align:text-bottom; text-align:left; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_37.jpg"> ・土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。</DD>
- ・水やりは最初の</DT>
- 2週間は水のみ、その後 1000倍ハイポネックッス /週1 </DD>
植物形質転換用バイナリーベクター
Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6535?6540, (1999)
<IMG width=359 height=92 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:77px; margin-left:389px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_39.jpg"> (平均インサート長: 80Kb)
1ベクターあたり感染:240切片馴化できた系統数: 0~21系統作出
カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります !!
Yoichi Ogawa ・ Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol 181 : 331.336
<IMG width=124 height=56 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:13px; margin-left:721px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_40.jpg">
Screening for highly active ?-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens