PlantBiotech:Species/Brachypodium distachyon

Revision as of 15:26, 10 August 2012

ブラキポディウム形質転換法

培地の調整

形質転換法

［実験方法］

1. ブラキポディウムの未熟種子をとる。

※さやの中で長さはいっぱいに育っているがまだ柔らかい状態が一番いい。

1. ハイターを10ml、水を20ml位の割合で混ぜ、Tween20を1～2滴加えてよく混ぜる。

1. 2. の液で未熟種子を3分程度滅菌する。

1. 3. を滅菌水で泡がなくなるまで洗う。

1. 先の細いピンセットを2本、実体顕微鏡、空のシャーレを1枚用意する。

1. 滅菌水と未熟種子を空のシャーレに入れ、実体顕微鏡で見ながら胚を取り出し、平たいほうを上にしてBDD1へ（25℃、暗所）。

1. 2週間が経ったら、クリーム色の硬いカルスだけを切り離してBDD2へ。10日たったら新しいBDD2に移植し、さらに10日間培養する（25℃、暗所）。

1. 形質転換に用いるアグロを適当な抗生物質を加えたLBにて一晩培養する。

1. 適当な抗生物質を加えたBDAに200μl伸ばし、28℃で2晩培養する。

1. 50mlのファルコンチューブに10mlの感染液を分注し、10μlのアセトシリンゴンを加える。

1. 空のシャーレに滅菌したろ紙を1枚押し込み、⑩の感染液を750μl入れてふたをしておく。

1. 薬匙でアグロをかきとり、10mlの感染液に懸濁する。

1. 28℃で45分間、220rpm。

1. OD600を量り、1になるように感染液で薄め、加えた感染液の1000分の1アセトシリンゴンを加える。

1. よいカルスを選んでBDD2に置く。

1. アグロ懸濁液13mlを集めたカルスのプレートに入れて5分間置く。

1. 滅菌紙で余分な水分を除去し、11. のシャーレにカルスを入れて、25℃、暗黒下で2日間。

1. 適当な抗生物質を加えたBDSE1にカルスを移して10日毎に新しい培地に移植しながら3週間培養する。このとき、アグロが増えすぎているカルスは捨てる。

1. BDSE2にカルスを移して10日毎に新しい培地に移植しながら3週間培養する。

1. 感染から6週間後、抗生物質耐性のカルスをBDR26に移して2～3週間培養する（25℃、長日条件）。

1. 発根したり、葉が出来たりしたカルスを3分の一MSに移して伸長させる。