PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum

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>以降</SPAN
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>本葉が出たもの</SPAN
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>作業中乾かないように注意</SPAN
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>!</SPAN
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>! </SPAN
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>子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床</SPAN
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>湿らし</SPAN
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>た
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</SPAN
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>ろ紙</SPAN
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>へ
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>1cm</SPAN
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<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
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>一時置き</SPAN
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+
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<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
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−
>作業は湿らせたろ紙の上で</SPAN
+
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+
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><Sub>MS+2mg/l Zeatin+3% Suc+0.8% Agar </Sub></SPAN
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+
−
<P style="margin-right:30px; line-height:35px">
+
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<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
><Sup>子葉を傷つけないように</Sup></SPAN
+
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><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>48</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
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>切片</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>/1</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>シャーレ</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>（ </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>9cm</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>深底シャーレ）</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
><Sup>胚軸は下の方を使う</Sup></SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>パラフィルムでシー</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>ル </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
><Sup>子葉の両端を切<SPAN style=" font-weight:normal"
+
−
>る </SPAN
+
−
></Sup></SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>2</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>日</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>間 </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>25</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>℃</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>,16h</SPAN
+
−
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+
−
>日長で培</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:22pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>養 </SPAN
+
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+
−
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+
−
<P style="margin-bottom:30px; line-height:45px">
+
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<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
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>前培養；</SPAN
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+
−
>LB</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>プレート</SPAN
+
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+
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>（ </SPAN
+
−
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+
−
>+</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリー</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>ク </SPAN
+
−
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+
−
<P style="text-align:justify; margin-bottom:22px; line-height:45px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
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>感染用培養；シングルコロニー</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
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>を </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>LB</SPAN
+
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><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
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>プレート（</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>+</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>抗生物質）にストリーク</SPAN
+
−
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−
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+
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+
−
<P style="text-align:justify">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>・</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意す</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>る
+
−
</SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="text-align:justify; margin-right:37px; margin-left:43px; text-indent:-20px; line-height:38px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>（導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>） </SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="text-align:center; margin-bottom:30px; line-height:32px">
+
−
<IMG width=121 height=79 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:30px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_15.jpg">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#FF0063"
+
−
>注）改善の余地あり</SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="margin-bottom:143px; margin-left:40px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>菌液の準備</SPAN
+
−
></P>
+
−
<IMG width=53 height=20 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:157px; margin-right:255px; margin-left:629px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_16.jpg">
+
−
<IMG width=100 height=56 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:157px; margin-right:625px; margin-left:212px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_17.jpg">
+
−
<IMG width=444 height=320 style="display:block; float:none; margin-bottom:157px; margin-right:245px; margin-left:249px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_18.jpg">
+
−
<IMG width=220 height=207 style="display:block; float:none; margin-bottom:157px; margin-right:357px; margin-left:361px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_19.jpg">
+
−
<P style="text-align:center; margin-bottom:-5px; margin-left:77px; line-height:32px">
+
−
<IMG width=68 height=151 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:-5px; margin-left:77px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_20.jpg">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>滅菌したキムタオル</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>で
+
−
</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>水分除</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>去
+
−
</SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="margin-bottom:160px; margin-right:620px; line-height:32px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>MS</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>液体培</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>地 </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>50ml</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>＋アセトシリンゴン</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>（ </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>10mg/L)</SPAN
+
−
></P>
+
−
<IMG width=220 height=209 style="display:block; float:none; margin-bottom:157px; margin-right:349px; margin-left:369px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_21.jpg">
+
−
<IMG width=21 height=49 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:157px; margin-right:122px; margin-left:794px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_22.jpg">
+
−
<IMG width=151 height=312 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:157px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_23.jpg">
+
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<IMG width=189 height=216 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:115px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_24.jpg">
+
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<IMG width=940 height=220 style="display:block; float:none; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_25.jpg">
+
−
<P style="margin-bottom:54px; margin-left:394px; line-height:32px">
+
−
<IMG width=121 height=80 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:54px; margin-left:394px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_26.jpg">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#FF0063"
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>注）改善の余地あり</SPAN
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−
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+
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<P style="margin-bottom:37px; margin-right:526px; line-height:32px">
+
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>MS</SPAN
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+
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>液体培地除</SPAN
+
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+
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+
−
<IMG width=571 height=403 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:25px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_27.jpg">
+
−
<IMG width=191 height=57 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:13px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_28.jpg">
+
−
<P>
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>2</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>週間</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>,25</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>℃</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>16h</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>日長</SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="margin-left:102px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>傷をつけないように気をつけ</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>る
+
−
</SPAN
+
−
></P>
+
−
<IMG width=524 height=157 style="display:block; float:none; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_29.jpg">
+
−
<P style="margin-bottom:22px; line-height:31px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>カルス誘導培</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>地 </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>MS+2mg/l Zeatin+</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>抗生物質</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar</SPAN
+
−
></P>
+
−
<IMG width=205 height=195 style="display:block; float:none; text-align:left" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_30.jpg">
+
−
<IMG width=124 height=56 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_31.jpg">
+
−
<P style="margin-bottom:30px; line-height:33px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>サージカルテープでシール（選</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>抜 </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>1</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>）パラフィルムでシール（選</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>抜 </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>2</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>） </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>24</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>切片</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>/1</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>シャーレ子葉は表面を上に・少し培地に埋め込む</SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="text-align:center; margin-bottom:15px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>選抜</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>3</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>回目（再分化誘導</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>）
+
−
</SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="margin-bottom:26px; line-height:31px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>再分化誘導培</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>地 </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>MS+1mg/l Zeatin+</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>抗生物質</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar </SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="margin-bottom:11px; margin-left:66px; line-height:31px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>パラフィルムでシー</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>ル </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>1</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>シャーレあた</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>り </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>20</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>切片以</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>下 </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>3</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落と</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>す </SPAN
+
−
></P>
+
−
<IMG width=124 height=56 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:0px; margin-right:180px; margin-left:420px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_32.jpg">
+
−
<IMG width=197 height=571 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:14px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_33.jpg">
+
−
<IMG width=568 height=157 style="display:block; float:none; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_34.jpg">
+
−
<P style="margin-bottom:37px; line-height:31px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>シュート伸長、発根誘導培</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>地 </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>MS+1mg/l IBA+</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>抗生物質</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar</SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="margin-bottom:37px; margin-left:8px; line-height:31px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す</SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="text-align:center; margin-bottom:15px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>選抜</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>5</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>回目（発根</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>）
+
−
</SPAN
+
−
></P>
+
−
<P style="margin-bottom:47px; margin-left:8px; line-height:31px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>発根誘導培</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>地 </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>MS+0.5mg/l IBA+</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>抗生物質</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar</SPAN
+
−
></P>
+
−
<IMG width=124 height=49 style="display:block; float:none; text-align:left; margin-bottom:-4px; margin-right:572px; margin-left:28px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_35.jpg">
+
−
<P style="margin-right:77px; line-height:30px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>シュートの条件：発根したカルスから取る・大きさ</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>（ </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>2cm</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>程度）発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除くアグロとエスケープを防ぐため、少なくと</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>も </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>3</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>回は頂芽を植継ぐ花芽は切り落と</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>す </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>!! </SPAN
+
−
></P>
+
−
<IMG width=775 height=480 style="display:block; float:none; margin-bottom:34px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_36.jpg">
+
−
<dl>
+
−
<DT>
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>・</SPAN
+
−
></DT>
+
−
<DD>
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>根を傷つけない</SPAN
+
−
></DD>
+
  
−
<DT style="margin-bottom:3px">
+
==トマト遺伝子導入実験プロトコール==
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>・</SPAN
+
−
></DT>
+
−
<DD style="margin-bottom:3px">
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>、
+
−
</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>1</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>。
+
−
</SPAN
+
−
></DD>
+
  
−
<DD>
+
{|
−
<IMG width=123 height=56 style="vertical-align:text-bottom; text-align:left; margin-bottom:0px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_37.jpg">
+
|
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
||[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-001.png|250px]]
−
>・土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。</SPAN
+
|
−
></DD>
+
2005. 6/27 改正版
 +
|}
  
−
<DT>
+
==形質転換スケジュール==
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
{|
−
>・水やりは最初の</SPAN
+
||[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-002.png|300px]]
−
></DT>
+
|}
−
<DD>
+
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>2</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>週間は水のみ、その</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>後 </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>1000</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>倍ハイポネックッ</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>ス </SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>/</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>週</SPAN
+
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
−
>1 </SPAN
+
−
></DD>
+
  
−
</dl>
+
==実験プロトコール==
−
<IMG width=121 height=80 style="display:block; float:none; margin-bottom:32px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_38.jpg">
+
 
−
<DIV class="Part"
+
===滅菌===
−
><H1>
+
<center>
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'HGP Gothic', sans-serif; font-size:31.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
<gallery perrow="4">
−
>植物形質転換用バイナリーベクタ</SPAN
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-003.png|700 mg/300 粒
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'HGP Gothic', sans-serif; font-size:31.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-004.png|70 % EtOH 2 分振とう
−
>ー </SPAN
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-005.png|
−
></H1>
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-006.png|1 % 次亜塩+ 200 μl/L tween 10 分振とう
−
<P style="text-align:; margin-bottom:37px; margin-right:37px; margin-left:45px">
+
</gallery>
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
</center>
−
>Liu et al. </SPAN
+
 
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-style:italic; font-weight:normal; color:#000000"
+
===洗浄===
−
>Proc. Natl. Acad. Sci. USA. </SPAN
+
クリーンベンチ作業
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:19.9pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
<center>
−
>96, 6535?6540, (1999) </SPAN
+
<gallery perrow="3">
−
></P>
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-007.png|洗浄前
−
<P style="text-align:; margin-bottom:77px; margin-left:389px">
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-008.png|SDWで 1 分間× 5 回洗浄
−
<IMG width=359 height=92 style="display:block; float:left; text-align:left; margin-bottom:77px; margin-left:389px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_39.jpg">
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-009.png|洗浄後
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:bold; color:#000000"
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</gallery>
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>(</SPAN
+
</center>
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
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;point
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>平均インサート長</SPAN
+
* 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
 
−
>： </SPAN
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===播種===
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><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:28pt; font-weight:bold; color:#000000"
+
クリーンベンチ作業
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>80Kb)</SPAN
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<center>
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></P>
+
<gallery perrow="3">
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<P style="margin-bottom:89px; line-height:38px">
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-010.png|1/2 MS+3 % Suc+ 0.8 % Agar pH 5.8 25 ℃, 16 h 日長で培養
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-011.png|50-60 粒/7 cm <br>マヨネーズ瓶
−
>1</SPAN
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-012.png|50 粒播種するとこんな感じ<br>→約 1 週間培養
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><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
</gallery>
−
>ベクターあたり感染：</SPAN
+
</center>
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><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
 
−
>240</SPAN
+
===前培養===
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
クリーンベンチ作業
−
>切片馴化できた系統数</SPAN
+
<center>
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
{|
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>： </SPAN
+
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-013.png|150px|thumb|作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように<br>胚軸は下の方を使う<br>子葉の両端を切る]]
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
|→湿らしたろ紙へ一時置き→
−
>0</SPAN
+
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|200px|thumb|MS+ 2 mg/l Zeatin+ 3 % Suc+0.8 % Agar<br>48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ）<br>パラフィルムでシール<br>→ 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養]]
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
|}
−
>～</SPAN
+
</center>
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
;point
−
>21</SPAN
+
* 本葉が出たものはNG。
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:24pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
* 作業中乾かないように注意!!
−
>系統作出</SPAN
+
* 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。
−
></P>
+
 
−
<P style="margin-right:191px; margin-left:156px; text-indent:-155px; line-height:26px">
+
===アグロバクテリウムの調整===
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
;　前培養；
−
>カルベニシリンより</SPAN
+
:　LBプレート（+抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
:　↓2 日間 28 ℃,暗所
−
>Meropenem</SPAN
+
:　
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
;　感染用培養；
−
>の方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もありま</SPAN
+
:　シングルコロニーをLBプレート（+抗生物質）にストリーク
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'MS', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
:　↓2 日間 28 ℃,暗所
−
>す </SPAN
+
:　
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
;point
−
>!! </SPAN
+
* 必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する。
−
></P>
+
* 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。
−
<P style="margin-bottom:26px; line-height:26px">
+
 
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:bold; color:#000000"
+
===感染===
−
>Yoichi Ogawa ・ Masahiro Mii </SPAN
+
;注）改善の余地あり
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
<center>
−
>(2004) </SPAN
+
<gallery perrow="5">
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:16pt; font-style:italic; font-weight:normal; color:#000000"
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-015.png|菌液の準備；<br>MS液体培地 50 ml +アセトシリンゴン(10 mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング
−
>Arch Microbiol </SPAN
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|切片を滅菌した茶漉しに入れ<br>菌液内で 1 分間攪拌
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|滅菌したキムタオルで<br>水分除去
−
>181 : 331.336 </SPAN
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-018.png|さらに水分除去
−
></P>
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|元の培地に<br>（3 日間, 21 ℃,遮光）
−
<IMG width=124 height=56 style="display:block; float:none; text-align:right; margin-bottom:13px; margin-left:721px" src="images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_40.jpg">
+
</gallery>
−
<P style="text-indent:156px; line-height:26px">
+
</center>
−
<SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
 
−
>Screening for highly active </SPAN
+
===除菌===
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial Unicode MS', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
;注）改善の余地あり
−
>?</SPAN
+
:　洗浄：MS液体培地
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:16pt; font-weight:normal; color:#000000"
+
:　除菌：MS液体培地+Cb 500 mg/l
−
>-lactam antibiotics against </SPAN
+
<center>
−
><SPAN style="font-family:'sans-serif', 'Arial', sans-serif; font-size:16pt; font-style:italic; font-weight:normal; color:#000000"
+
<gallery perrow="2">
−
>Agrobacterium tumefaciens </SPAN
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|2,3 分ゆすりながら洗う<br>洗浄 1 回/除菌 1 回
−
></P>
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|水分除去→選抜へ<br>(2 週間, 25 ℃, 16 h 日長)
−
</DIV>
+
</gallery>
 +
</center>
 +
;point
 +
* 傷をつけないように気をつける。
 +
 
 +
===選抜===
 +
{|
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|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|150px]]
 +
|
 +
; 選抜1,2回目（カルス誘導）
 +
: カルス誘導培地：MS+ 2 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+0.8 % Agar
 +
; point
 +
* サージカルテープでシール（選抜 1）。
 +
* パラフィルムでシール（選抜 2）。
 +
* 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
 +
|-
 +
|
 +
|
 +
; 選抜3回目（再分化誘導）
 +
: 再分化誘導培地 MS+ 1 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar
 +
; point
 +
* パラフィルムでシール。
 +
* 1シャーレあたり 20切片以下。
 +
* 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
 +
|-
 +
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-019.png|150px]]
 +
|　
 +
; 選抜4回目（シュート伸長・発根）
 +
: シュート伸長・発根誘導培地：MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
 +
: カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
 +
:　
 +
|-
 +
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png|150px]]
 +
|　
 +
; 選抜5回目（発根）
 +
: 発根誘導培地：MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
 +
; point
 +
* シュートの条件：発根したカルスから取る。大きさ（ 2cm程度。
 +
* 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。
 +
* アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。
 +
* 花芽は切り落とす!!
 +
|}
 +
 
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===馴化===
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<center>
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{|
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|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png|150px|thumb|]]
 +
| →
 +
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-021.png|150px|thumb|]]
 +
|}
 +
</center>
 +
; point
 +
* 根を傷つけない
 +
* ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
 +
* 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
 +
* 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。
 +
 
 +
===効率===
 +
; 植物形質転換用バイナリーベクター
 +
: Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
 +
{|
 +
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-022.png|200px]]
 +
|
 +
; (平均インサート長：80 Kb)
 +
: 1ベクターあたり
 +
: 　感染：240 切片
 +
: 　馴化できた系統数： 0-21 系統作出
 +
|}
 +
; point
 +
* カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
 +
: Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
 +
: Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens

Latest revision as of 16:04, 1 September 2011

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Contents

[edit] トマト遺伝子導入実験プロトコール

Horticulture-Solanum-lycopersicum-001.png

2005. 6/27 改正版

[edit] 形質転換スケジュール

Horticulture-Solanum-lycopersicum-002.png

[edit] 実験プロトコール

[edit] 滅菌

  • 700 mg/300 粒

  • 70 % EtOH 2 分振とう

  • Horticulture-Solanum-lycopersicum-005.png

  • 1 % 次亜塩+ 200 μl/L tween 10 分振とう

[edit] 洗浄

クリーンベンチ作業

  • 洗浄前

  • SDWで 1 分間× 5 回洗浄

  • 洗浄後

point
  • 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。

[edit] 播種

クリーンベンチ作業

  • 1/2 MS+3 % Suc+ 0.8 % Agar pH 5.8 25 ℃, 16 h 日長で培養

  • 50-60 粒/7 cm
    マヨネーズ瓶

  • 50 粒播種するとこんな感じ
    →約 1 週間培養

[edit] 前培養

クリーンベンチ作業

作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように
胚軸は下の方を使う
子葉の両端を切る
 →湿らしたろ紙へ一時置き→
MS+ 2 mg/l Zeatin+ 3 % Suc+0.8 % Agar
48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ）
パラフィルムでシール
→ 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養
point
  • 本葉が出たものはNG。
  • 作業中乾かないように注意!!
  • 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。

[edit] アグロバクテリウムの調整

　前培養；
　LBプレート（+抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
　↓2 日間 28 ℃,暗所
　
　感染用培養；
　シングルコロニーをLBプレート（+抗生物質）にストリーク
　↓2 日間 28 ℃,暗所
　
point
  • 必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する。
  • 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。

[edit] 感染

注）改善の余地あり

  • 菌液の準備；
    MS液体培地 50 ml +アセトシリンゴン(10 mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング

  • 切片を滅菌した茶漉しに入れ
    菌液内で 1 分間攪拌

  • 滅菌したキムタオルで
    水分除去

  • さらに水分除去

  • 元の培地に
    （3 日間, 21 ℃,遮光）

[edit] 除菌

注）改善の余地あり
　洗浄：MS液体培地
　除菌：MS液体培地+Cb 500 mg/l

  • 2,3 分ゆすりながら洗う
    洗浄 1 回/除菌 1 回

  • 水分除去→選抜へ
    (2 週間, 25 ℃, 16 h 日長)

point
  • 傷をつけないように気をつける。

[edit] 選抜

Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png
選抜1,2回目（カルス誘導）
カルス誘導培地：MS+ 2 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+0.8 % Agar
point
  • サージカルテープでシール（選抜 1）。
  • パラフィルムでシール（選抜 2）。
  • 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
選抜3回目（再分化誘導）
再分化誘導培地 MS+ 1 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar
point
  • パラフィルムでシール。
  • 1シャーレあたり 20切片以下。
  • 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
Horticulture-Solanum-lycopersicum-019.png 　
選抜4回目（シュート伸長・発根）
シュート伸長・発根誘導培地：MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
　
Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png 　
選抜5回目（発根）
発根誘導培地：MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
point
  • シュートの条件：発根したカルスから取る。大きさ（ 2cm程度。
  • 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。
  • アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。
  • 花芽は切り落とす!!

[edit] 馴化

Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png
→
Horticulture-Solanum-lycopersicum-021.png
point
  • 根を傷つけない
  • ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
  • 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
  • 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。

[edit] 効率

植物形質転換用バイナリーベクター
Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
Horticulture-Solanum-lycopersicum-022.png
(平均インサート長：80 Kb)
1ベクターあたり
　感染：240 切片
　馴化できた系統数： 0-21 系統作出
point
  • カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens
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