PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum
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2005.6/27改正版 | 2005.6/27改正版 | ||
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| − | + | ===播種=== | |
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| − | + | ===前培養=== | |
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前培養；LBプレート（ +抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク | 前培養；LBプレート（ +抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク | ||
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感染用培養；シングルコロニーを LBプレート（+抗生物質）にストリーク | 感染用培養；シングルコロニーを LBプレート（+抗生物質）にストリーク | ||
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・必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する | ・必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する | ||
| − | + | （導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備 | |
| − | + | と良い） | |
| − | + | images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_15.jpg注）改善の余地あり | |
| − | + | 菌液の準備 | |
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| + | _img_17.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_18.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プ | ||
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| + | ロトコール_img_19.jpg | ||
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| + | images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_20.jpg滅菌したキムタオルで 水分除去 | ||
MS液体培地 50ml＋アセトシリンゴン（ 10mg/L) | MS液体培地 50ml＋アセトシリンゴン（ 10mg/L) | ||
| − | images/ | + | images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_21.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール |
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| + | ロトコール_img_24.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_25.jpg | ||
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| + | images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_26.jpg注）改善の余地あり | ||
洗浄 MS液体培地除菌 MS液体培地+Cb 500mg/l | 洗浄 MS液体培地除菌 MS液体培地+Cb 500mg/l | ||
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2週間,25℃16h日長 | 2週間,25℃16h日長 | ||
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傷をつけないように気をつける | 傷をつけないように気をつける | ||
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カルス誘導培地 MS+2mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar | カルス誘導培地 MS+2mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar | ||
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| − | サージカルテープでシール（選抜 1）パラフィルムでシール（選抜 2） 24切片/ | + | _img_31.jpg |
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| + | サージカルテープでシール（選抜 1）パラフィルムでシール（選抜 2） 24切片/1シャーレ子葉は表 | ||
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| + | 面を上に・少し培地に埋め込む | ||
選抜3回目（再分化誘導） | 選抜3回目（再分化誘導） | ||
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再分化誘導培地 MS+1mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar | 再分化誘導培地 MS+1mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar | ||
| − | パラフィルムでシール 1シャーレあたり 20切片以下 | + | パラフィルムでシール 1シャーレあたり 20切片以下 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り |
| − | images/ | + | 落とす |
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| + | images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_32.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール | ||
| + | |||
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シュート伸長、発根誘導培地 MS+1mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar | シュート伸長、発根誘導培地 MS+1mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar | ||
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発根誘導培地 MS+0.5mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar | 発根誘導培地 MS+0.5mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar | ||
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| − | シュートの条件：発根したカルスから取る・大きさ（ | + | シュートの条件：発根したカルスから取る・大きさ（ 2cm程度）発根を阻害されるのでカルスはきれ |
| − | images/ | + | いに取り除くアグロとエスケープを防ぐため、少なくとも 3回は頂芽を植継ぐ花芽は切り落とす !! |
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; ・ | ; ・ | ||
: 根を傷つけない | : 根を傷つけない | ||
; ・ | ; ・ | ||
| − | : ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 | + | : ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1週間程度かけてサランラップをあ |
| − | : images/ | + | |
| + | けて湿度を下げていく。 | ||
| + | : images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_37.jpg・土でも馴化できるが、湿度には十分注意 | ||
| + | |||
| + | する。 | ||
; ・水やりは最初の | ; ・水やりは最初の | ||
: 2週間は水のみ、その後 1000倍ハイポネックッス /週1 | : 2週間は水のみ、その後 1000倍ハイポネックッス /週1 | ||
| − | images/ | + | images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_38.jpg |
h1. 植物形質転換用バイナリーベクター | h1. 植物形質転換用バイナリーベクター | ||
| − | Liu et al. _Proc. Natl. Acad. Sci. USA. _96, | + | Liu et al. _Proc. Natl. Acad. Sci. USA. _96, 6535–6540, (1999) |
| − | images/ | + | images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_39.jpg*(*平均インサート長： *80Kb)* |
1ベクターあたり感染：240切片馴化できた系統数： 0～21系統作出 | 1ベクターあたり感染：240切片馴化できた系統数： 0～21系統作出 | ||
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カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります !! | カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります !! | ||
| − | *Yoichi Ogawa | + | *Yoichi Ogawa · Masahiro Mii *(2004) _Arch Microbiol _181 : 331.336 |
| − | images/ | + | images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_40.jpg |
| − | Screening for highly active | + | Screening for highly active ˟-lactam antibiotics against _Agrobacterium tumefaciens _ |
Revision as of 11:09, 4 July 2011
Contents |
トマト遺伝子導入実験プロトコール
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_01.jpg
2005.6/27改正版
形質転換スケジュール
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_02.jpg
滅菌
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_03.jpg
洗浄
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_04.jpg
播種
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_05.jpg
前培養
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_06.jpg
前培養；LBプレート（ +抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_12.jpg
感染用培養；シングルコロニーを LBプレート（+抗生物質）にストリーク
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_13.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール
_img_14.jpg
・必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する
（導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備
と良い）
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_15.jpg注）改善の余地あり
菌液の準備
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_16.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール
_img_17.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_18.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プ
ロトコール_img_19.jpg
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_20.jpg滅菌したキムタオルで 水分除去
MS液体培地 50ml＋アセトシリンゴン（ 10mg/L)
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_21.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール
_img_22.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_23.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プ
ロトコール_img_24.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_25.jpg
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_26.jpg注）改善の余地あり
洗浄 MS液体培地除菌 MS液体培地+Cb 500mg/l
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_27.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール
_img_28.jpg
2週間,25℃16h日長
傷をつけないように気をつける
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_29.jpg
カルス誘導培地 MS+2mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_30.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール
_img_31.jpg
サージカルテープでシール（選抜 1）パラフィルムでシール（選抜 2） 24切片/1シャーレ子葉は表
面を上に・少し培地に埋め込む
選抜3回目（再分化誘導）
再分化誘導培地 MS+1mg/l Zeatin+抗生物質+250mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
パラフィルムでシール 1シャーレあたり 20切片以下 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り
落とす
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_32.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール
_img_33.jpgimages/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_34.jpg
シュート伸長、発根誘導培地 MS+1mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
選抜5回目（発根）
発根誘導培地 MS+0.5mg/l IBA+抗生物質+125mg/l Cb+3% Suc+0.8% Agar
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_35.jpg
シュートの条件：発根したカルスから取る・大きさ（ 2cm程度）発根を阻害されるのでカルスはきれ
いに取り除くアグロとエスケープを防ぐため、少なくとも 3回は頂芽を植継ぐ花芽は切り落とす !!
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_36.jpg
- ・
- 根を傷つけない
- ・
- ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1週間程度かけてサランラップをあ
けて湿度を下げていく。
- images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_37.jpg・土でも馴化できるが、湿度には十分注意
する。
- ・水やりは最初の
- 2週間は水のみ、その後 1000倍ハイポネックッス /週1
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_38.jpg
h1. 植物形質転換用バイナリーベクター
Liu et al. _Proc. Natl. Acad. Sci. USA. _96, 6535–6540, (1999)
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_39.jpg*(*平均インサート長： *80Kb)*
1ベクターあたり感染：240切片馴化できた系統数： 0～21系統作出
カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります !!
- Yoichi Ogawa · Masahiro Mii *(2004) _Arch Microbiol _181 : 331.336
images/トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_40.jpg
Screening for highly active ˟-lactam antibiotics against _Agrobacterium tumefaciens _
