PlantBiotech:Species/Oryza sativa

アグロバクテリウム法によるイネの形質転換

Agrobacterium-mediated transformation of rice

イネはアグロバクテリウムの宿主でないため，イネへの遺伝子導入はエレクトロポレーションやパーティクルガン等の直接導入法が主流であった。近年アグロバクテリウムを介した間接導入法が適用され，未経験者でも容易にイネに遺伝子を導入できるようになった。

Application of Agrobacterium-mediated gene transfer to rice transformation enabled us to produce transgenic rice plants efficiently and easily.

• 誌名：低温科学（Low Temperature Science） vol.67, 641-647 (2009)
• 著者：Chisato Masumoto, Mitsue Miyao

　　　増本千都, 宮尾光恵（農業生物資源研究所・光環境応答研究ユニット）

• 出版者：北海道大学低温科学研究所（Institute of Low Temperature Science, Hokkaido University）
• 引用：「光合成研究法」北海道大学低温科学研究所, 日本光合成研究会共編
• Doc URL：http://hdl.handle.net/2115/39205

7.1原理と概要

　従来イネへの遺伝子導入は，プロトプラストを用いたエレクトロポレーション法やPEG（ポリエチレングリコール）法，カルスを用いたパーティクルガン法等，直接導入法が中心であった。1994年にアグロバクテリウム （Rhizobium radiobacter；旧称Agrobacterium tumefaciens）を介したイネへの遺伝子導入法が開発された¹⁾。本法では特殊な装置が不要で操作も簡単であり，かつ高効率で完全長の遺伝子をゲノムに導入できる。遺伝子導入法と培地組成^2)-6)，また遺伝子導入用バイナリーベクターと選抜薬剤耐性マーカー遺伝子にも改良が重ねられ，現在では未経験者でも簡単に形質転換イネが作製できるようになった。単子葉植物であるイネはアグロバクテリウムの宿主範囲外である。アグロバクテリウムの宿主となる双子葉植物では，アグロバクテリウムが感染するとTiプラスミドのVir領域を活性化するフェノール化合物（アセトシリンゴン，シナピン酸等）が合成され，

TiプラスミドからT-DNAが切り出され，いくつかの過程を経て宿主の核染色体DNAに組み込まれる。イネはこれらのフェノール化合物を合成しないためアグロバクテリウム法が適用できなかったが，アグロバクテリウム感染時にアセトシリンゴンを添加することによって，アグロバクテリウムを介した遺伝子導入が可能になった¹⁾。現在用いられている一般的な方法は，再分化能が高い種子胚盤由来のカルスにアグロバクテリウムを感染させる方法（カルス法）で，遺伝子が導入されたカルスを薬剤（抗生物質）耐性で選抜したのち，植物体を再分化させる。感染から約３ヶ月で形質転換イネが得られる。種子に直接アグロバクテリウムを感染させカルス培養期間を短縮する方法（種子法）も報告されている⁶⁾。イネへの遺伝子導入効率が高いことから，アグロバクテリウムの系統EHA101とEHA105がもっともよく使われている。 EHA105は，カナマイシン耐性（ Km?）のEHA101からカナマイシン耐性遺伝子を除いた系統で，バイナリーベクター（ Km?）が導入されたアグロバクテリウムをカナマイシン耐性で確実に選抜することができる。選抜用薬剤としては，ハイグロマイシン（ hygromycin， Hm；原核型タンパク質合成阻害剤）が汎用されている。しかし，ハイグロマイシンの場合は耐性カルスの選抜が難しいことから，ビアラフォス（ biala- phos；グルタミン合成酵素阻害剤）， ALS （アセト乳酸脱水素酵素）阻害剤等，除草剤を選抜薬剤として用いる方法が複数開発されている。バイナリーベクターは， pBI101由来のベクターに薬剤耐性遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子，hpt；ビアラフォス耐性遺伝子，bar等）を導入したもの（例えば， pBI101Hm， pIG121Hm， pGPTVbar）が汎用されている。また，市販のpCAMBIAシリーズも使用できる（ pBI101系ベクターに比べて大腸菌内での増幅コピー数が多い）。以下にカルス法による遺伝子導入の概要を示す。 １．種子からのカルス誘導（3週間）種子をオーキシン（ 2,4-D）を含む培地で培養し，胚盤からカルスを誘導。 ２．カルスの前培養（ 2,4-Dを含む培地；３日間）アグロバクテリウム感染に先立ち，カルスの増殖能を高める。６ ３．アグロバクテリウムの前培養（3日間）グリセロールストックからアグロバクテリウムを増殖。 ４．カルスのアグロバクテリウム感染（3日間）カルスにアグロバクテリウムを接種し，アセトシリンゴン存在下で共存培養し感染させる。 ５．アグロバクテリウムの除去と薬剤選抜（ 2週間×１または×２）カルスをカルベニシリン（ carbenicillin；グラム陰性桿菌用抗生物質，アグロバクテリウム除菌用）溶液で洗浄し，アグロバクテリウムを除去。引き続き，カルベニシリンと選抜薬剤を含むカルス増殖培地（ 2,4-Dを含む）でカルスを選抜。 ６．植物体の再分化（1-2週間）オーキシン（ナフタレン酢酸； NAA），サイトカイニン（カイネチン），選抜薬剤，カルベニシリンを含む培地で培養し，遺伝子が導入されたカルスから植物体を再分化。 ７．根の伸長促進と再分化植物の育成（ 2-3週間）ホルモン（オーキシン，サイトカイニン）を含まない培地（選抜薬剤を含む）で根を伸長させ，植物体を大きくする。 ８．再分化植物の土壌への移植。

7.2イネへの遺伝子導入法アグロバクテリウムEHA株， pBI系あるいはpCAM- BIA系バイナリーベクター，選抜薬剤としてハイグロマイシンとビアラフォスを用いたカルス法^3),4)。を若干改変）を紹介する。種子法に比べて時間がかかるものの，少ない種子から多数の形質転換イネが得られる。一般的な日本型イネ品種（日本晴，キタアケ，農林６号，農林８号：日本晴型）に用いられる培地組成と作製法を表1-3に示す。日本晴はカルス培養が容易な品種であり， 50％以上の種子から増殖能の高いカルスが得られ，遺伝子導入効率（最終的に得られる形質転換イネの個体数）はアグロバクテリウムを感染させたカルス数の50％に達する。キタアケの場合は，日本晴に比べるとカルスの増殖が若干悪く，遺伝子導入効率は10-20％である。コシヒカリ，あきたこまち，ひとめぼれはカルス培養が困難な品種として知られている。これはカルスの亜硝酸還元酵素活性が低いことが原因で，一般的な培養条件では亜硝酸が蓄積し，カルスが褐変，壊死するためである⁷⁾。これらの品種でも培地組成を改良することで遺伝子導入が可能になっている⁷⁾。アグロバクテリウムは28℃，暗所で培養する。カルスと植物体は28-33℃，明所

■■■（30μmol photons m^-2s^-1）で培養する。シャーレはガンマ線滅菌されたプラスチックシャーレ（直径9cm，深さ20mm（アグロバクテリウム用のみ深さ15mm）)を用い，培地を入れたプレートはサージカルテープでシールする。 2-3日間室温で保存し，カビ等が生えていないこと確認してから４℃で保存。 ３ヶ月以上は保存しない。選抜に用いるハイグロマイシン，ビアラフォス濃度はそれぞれ50， 5mg/lである（日本晴，キタアケの場合）。

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2009低温科学vol.67 641-7

５章形質転換 ７．アグロバクテリウム法によるイネの形質転換 増本千都１)，宮尾光恵２)

１)農業生物資源研究所光環境応答研究ユニット２)農業生物資源研究所光環境応答研究ユニット

イネはアグロバクテリウムの宿主でないため，イネへの遺伝子導入はエレクトロポレーションやパーティクルガン等の直接導入法が主流であった．近年アグロバクテリウムを介した間接導入法が適用され，未経験者でも容易にイネに遺伝子を導入できるようになった． -mediated transformation of rice Chisato Masumoto, Mitsue Miyao

Application of Agrobacterium-mediated gene transfer to rice transformation enabled us to produce transgenic rice plants efficiently and easily.

7.1原理と概要従来イネへの遺伝子導入は，プロトプラストを用いたエレクトロポレーション法やPEG（ポリエチレングリコール）法，カルスを用いたパーティクルガン法等，直接導入法が中心であった．1994年にアグロバクテリウム Rhizobium radiobacter；旧称Agrobacterium tumefaciens）を介したイネへの遺伝子導入法が開発された??．本法では特殊な装置が不要で操作も簡単であり，かつ高効率で完全長の遺伝子をゲノムに導入できる．遺伝子導入法と培地組成????，また遺伝子導入用バイナリーベクターと選抜薬剤耐性マーカー遺伝子にも改良が重ねられ，現在では未経験者でも簡単に形質転換イネが作製できるようになった．単子葉植物であるイネはアグロバクテリウムの宿主範囲外である．アグロバクテリウムの宿主となる双子葉植物では，アグロバクテリウムが感染するとTiプラスミドのVir領域を活性化するフェノール化合物（アセトシリンゴン，シナピン酸等）が合成され， TiプラスミドからT-DNAが切り出され，いくつかの過程を経て宿主の核染色体DNAに組み込まれる．イネはこれらのフェノール化合物を合成しないためアグロバクテリウム法が適用できなかったが，アグロバクテリウム感染時にアセトシリンゴンを添加することによって，アグロバクテリウムを介した遺伝子導入が可能になった??．現在用いられている一般的な方法は，再分化能が高い種子胚盤由来のカルスにアグロバクテリウムを感染させる方法（カルス法）で，遺伝子が導入されたカルスを薬剤（抗生物質）耐性で選抜したのち，植物体を再分化させる．感染から約３ヶ月で形質転換イネが得られる．種子に直接アグロバクテリウムを感染させカルス培養期間を短縮する方法（種子法）も報告されている??．イネへの遺伝子導入効率が高いことから，アグロバクテリウムの系統EHA101とEHA105がもっともよく使われている． EHA105は，カナマイシン耐性（ Km?）のEHA101からカナマイシン耐性遺伝子を除いた系統で，バイナリーベクター（ Km?）が導入されたアグロバクテリウムをカナマイシン耐性で確実に選抜することができる．選抜用薬剤としては，ハイグロマイシン（ hygromycin， Hm；原核型タンパク質合成阻害剤）が汎用されている．しかし，ハイグロマイシンの場合は耐性カルスの選抜が難しいことから，ビアラフォス（ biala- phos；グルタミン合成酵素阻害剤）， ALS （アセト乳酸脱水素酵素）阻害剤等，除草剤を選抜薬剤として用いる方法が複数開発されている．バイナリーベクターは， pBI101由来のベクターに薬剤耐性遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子，hpt；ビアラフォス耐性遺伝子，bar等）を導入したもの（例えば， pBI101Hm， pIG121Hm， pGPTVbar）が汎用されている．また，市販のpCAMBIAシリーズも使用できる（ pBI101系ベクターに比べて大腸菌内での増幅コピー数が多い）．以下にカルス法による遺伝子導入の概要を示す． １．種子からのカルス誘導（3週間）種子をオーキシン（ 2,4-D）を含む培地で培養し，胚盤からカルスを誘導． ２．カルスの前培養（ 2,4-Dを含む培地；３日間）アグロバクテリウム感染に先立ち，カルスの増殖能を高める． ３．アグロバクテリウムの前培養（3日間）グリセロールストックからアグロバクテリウムを増殖． ４．カルスのアグロバクテリウム感染（3日間）カルスにアグロバクテリウムを接種し，アセトシリンゴン存在下で共存培養し感染させる． ５．アグロバクテリウムの除去と薬剤選抜（ 2週間×１または×２）カルスをカルベニシリン（ carbenicillin；グラム陰性桿菌用抗生物質，アグロバクテリウム除菌用）溶液で洗浄し，アグロバクテリウムを除去．引き続き，カルベニシリンと選抜薬剤を含むカルス増殖培地（ 2,4-Dを含む）でカルスを選抜． ６．植物体の再分化（1-2週間）オーキシン（ナフタレン酢酸； NAA），サイトカイニン（カイネチン），選抜薬剤，カルベニシリンを含む培地で培養し，遺伝子が導入されたカルスから植物体を再分化． ７．根の伸長促進と再分化植物の育成（ 2-3週間）ホルモン（オーキシン，サイトカイニン）を含まない培地（選抜薬剤を含む）で根を伸長させ，植物体を大きくする． ８．再分化植物の土壌への移植

7.2イネへの遺伝子導入法アグロバクテリウムEHA株， pBI系あるいはpCAM- BIA系バイナリーベクター，選抜薬剤としてハイグロマイシンとビアラフォスを用いたカルス法（文献????を若干改変）を紹介する．種子法に比べて時間がかかるものの，少ない種子から多数の形質転換イネが得られる．一般的な日本型イネ品種（日本晴，キタアケ，農林６号，農林８号：日本晴型）に用いられる培地組成と作製法を表1-3に示す．日本晴はカルス培養が容易な品種であり， 50％以上の種子から増殖能の高いカルスが得られ，遺伝子導入効率（最終的に得られる形質転換イネの個体数）はアグロバクテリウムを感染させたカルス数の50％に達する．キタアケの場合は，日本晴に比べるとカルスの増殖が若干悪く，遺伝子導入効率は10-20％である．コシヒカリ，あきたこまち，ひとめぼれはカルス培養が困難な品種として知られている．これはカルスの亜硝酸還元酵素活性が低いことが原因で，一般的な培養条件では亜硝酸が蓄積し，カルスが褐変，壊死するためである??．これらの品種でも培地組成を改良することで遺伝子導入が可能になっている??．アグロバクテリウムは28℃，暗所で培養する．カルスと植物体は28-33℃，明所（30μmol photons m??s??）で培養する．シャーレはガンマ線滅菌されたプラスチックシャーレ（直径9cm，深さ20mm （アグロバクテリウム用のみ深さ15mm）)を用い，培地を入れたプレートはサージカルテープでシールする． 2-3日間室温で保存し，カビ等が生えていないこと確認してから４℃で保存． ３ヶ月以上は保存しない．選抜に用いるハイグロマイシン，ビアラフォス濃度はそれぞれ50， 5mg/lである（日本晴，キタアケの場合）．

7.2.1種子の選別，種子滅菌とカルス誘導玄米を2,4-Dを含むカルス誘導用プレート（ N6D培地）で培養し，胚盤からカルスを誘導・増殖させる．

［準備］種子（ ）約150粒；小型すり器（藤原製作所）；プラスチックシャーレ； 70％エタノール；次亜塩素酸ナトリウム溶液（食品添加物用，有効塩素濃度約５％）； Tween20； 50mlファルコンチューブ；滅菌水約1l；レシプロ型振盪機；オートクレーブ滅菌した濾紙（直径7cm，数～10枚）；オートクレーブ滅菌したピンセット； N6Dプレート10枚．サージカルテープ．

［実験方法］ １．よく充実した種子（ ）を選ぶ．黒ずんだり傷のあるは使わない．小型摺り器で殻を取り除く．白色半透明の玄米100-150粒を選抜する．緑色あるいは黒ずんだ玄米はカビ等の混入の原因となるので除く． ２．滅菌溶液を作製する． 50mlファルコンチューブに次亜塩素酸ナトリウム溶液20ml，滅菌水20ml， Tween 20を１滴入れる．チューブ２本を用時調製． ３．選抜した玄米100-150粒をシャーレに入れる．玄米が浸かる程度に70％エタノールを加え，30秒間手で軽く振盪したのち， 70％エタノールを素早く捨てる．この操作で滅菌溶液を浸透しやすくする． ４．玄米を滅菌溶液に移し，150-200rpmで15分間振盪する． ５．デカントで滅菌溶液を交換し，15分間振盪する．以下はクリーンベンチ内で作業する． ６．チューブをデカントして滅菌溶液を捨て，新たに滅菌水40 mlを入れ玄米をすすぐ．この操作を5-6回繰り返し，最後に洗浄水を捨てる． ７．プラスチックシャーレに滅菌濾紙を数枚入れ，その上に滅菌した玄米を広げ水を切る． ８．ピンセットで玄米をN6Dプレートに置床する（プレート１枚あたり10粒；プレート10枚）．この時，胚だけ培地から出るようにする．シャーレをサージカルテープでシールする． ９．30-33℃で21日間培養する（暗所，明所どちらでも構わない）． ●培養開始後数日間は，カビや雑菌が発生していないか毎日チェックする（雑菌等が生えると種子のまわりが白濁する．プレートを光にかざすとわかりやすい）．雑菌等が生えた種子は取り除く．種子を除いても雑菌は残されたままなので，雑菌発生場所近傍の種子から増殖したカルスは使用しない． ●誘導されたカルスを培地に直接置き直すと，増殖が促進される． ●カルスの増殖が悪い場合（多くは褐色を呈する）は，培地のカザミノ酸（窒素源）濃度を上げると改善されることが多い．

7.2.2カルスの前培養（感染３日前に開始）増殖能の高いカルス選抜し，新しいN6Dプレートに移植する．アグロバクテリウムを感染させるカルスの増殖能が遺伝子導入効率に大きく影響する．胚盤上で増殖したカルスの塊より，塊からこぼれ落ちたカルスの方が増殖能が高い．褐色がかったカルスは増殖能が低いので使用しない．カルスの増殖に問題がなければ，玄米１個から感染に使用できるカルスが5-20個取れる． ［準備］ N6Dプレート２枚；ピンセット（滅菌済み）；サージカルテープ． ［実験方法］ １．直径約2-3mmの淡黄色で固いカルスを選び，ピンセットで新しいN6Dプレートに置床する（プレート１枚あたり200個，プレート２枚）．この時カルスをプレートに軽く押しつけるようにする． ２．30-33℃，３日間培養する（暗所，明所どちらでも構わない）．

7.2.3アグロバクテリウムの前培養（感染３日前に開始）バイナリーベクターを導入したアグロバクテリウムを増殖させる．ハイグロマイシン選抜の場合，カナマイシンとハイグロマイシンを含む培地（ AB培地）で培養する．ビアラフォス選抜の場合，カナマイシンのみを含む培地を使用する．

［準備］ ABプレート（カルス400個あたり１枚）；白金耳または滅菌済みミクロスパーテル；サージカルテープ．

［実験方法］ １．アグロバクテリウムのグリセロールストックの表面を白金耳またはミクロスパーテルでき取る． ２． ABプレートにアグロバクテリウムを塗布し，サージカルテープでシールする． ３． 28℃，暗所で３日間培養する．30℃を越えるとアグロバクテリウムからプラスミドが脱落しやすくなるので培養温度に注意する．

7.2.4アグロバクテリウムの接種と共存培養カルスにアグロバクテリウムを接種したのち，３日間共存培養して感染させる．接種時のアグロバクテリウム濃度が低い方が感染効率が高い．アグロバクテリウム懸濁液がかすかに濁るか濁らない程度で充分である．

［準備］ 50mlファルコンチューブ； AAM培地；アセトシリンゴン溶液； 2N6ASプレート１枚；滅菌した濾紙（直径7cm）；ミクロスパーテル（滅菌済み）；駒込ピペット（10ml，滅菌済み）；ステンレス製茶こし（滅菌済み）；ピンセット（滅菌済み）；プラスチックシャーレ．

［実験方法］ １． 50 mlファルコンチューブにAAM培地40mlを入れ，アセトシリンゴン溶液（100mg/ml）を4μl加える（終濃度10mg/l）． ２． 2N6ASプレート上に滅菌した濾紙をのせ，その上にステップ１のアセトシリンゴン入りAAM培地を1 ml注ぐ． ３．茶こしを空のプラスチックシャーレに置く．シャーレの蓋に滅菌濾紙を2-3枚敷く． ４．前培養したアグロバクテリウムをミクロスパーテルでき取り（ミクロスパーテルの1/5程度，約5μl；図1），ステップ１のAAM培地（約40ml）に懸濁する．懸濁液を駒込めピペットで100回程度ピペッティングしてアグロバクテリウムを分散させる． ５．プラスチックシャーレに置いた茶こし（ステップ３）に前培養したカルスを約200個入れる（100-200個）．この時，直径約2 mmの淡黄色の固いカルスを選ぶ． ６．カルスにアグロバクテリウム懸濁液（約40ml）をかけ，茶こしを時々揺すりながら90-120秒間アグロバクテリウムを接種する． ７．シャーレの蓋に敷いたろ紙（ステップ３）の上に茶こしを置き，アグロバクテリウム懸濁液を切る． ８． 2N6ASプレート上に敷いた濾紙（ステップ２）にカルスを置床し（プレート１枚あたり約200個），サージカルテープでシールする． ９． 28℃，暗所で３日間培養する．３日間培養するとアグロバクテリウムがカルスを覆うように増殖する．

--- 図1： AB培地で３日間培養したアグロバクテリウム．コロニーが判別できる程度に増殖したところ（丸で囲んだ部分）の菌体をミクロスパーテルでき取り，アグロバクテリウム感染用のAAM培地40mlに懸濁する． ---

7.2.5アグロバクテリウムの除去（除菌）とカルスの薬剤選抜アグロバクテリウムと共存培養したカルスをカルベニシリン溶液（ 500mg/l）で洗浄したのち，カルベニシリン（300mg/l）と選抜薬剤を含むN6D培地で培養し，薬剤耐性カルスを選抜する．２週間の薬剤選抜を２回繰り返すのが一般的であるが，ハイグロマイシン選抜の場合は耐性カルスと感受性カルスの区別がつきにくいため， ２週間選抜培地で培養したのち，再分化を開始する．選抜培地での培養は除菌効果が高いため，最低１回は行う．ビアラフォス選抜の場合は，２回（２週間×２）または３回（２週間×２， 7-10日間×１）の培養で耐性カルスが選抜できる（感受性カルスは増殖せず，褐変する）． ［準備］ 50mlファルコンチューブ；滅菌水；カルベニシリンストック溶液；選抜用N6Dプレート（選抜１回あたり８枚）；ピンセット（滅菌済み）；サージカルテープ． ［実験方法］ １．滅菌水40mlを入れた50mlファルコンチューブに共存培養したカルス約200個（ 100-200個）を入れる．蓋をしてチューブを数回反転させ，カルスを洗浄する．この操作を５回繰り返す． ２．同様に，500mg/lカルベニシリン溶液（滅菌水40mlにカルベニシリンストック溶液を100μl添加）でカルスを３回洗浄する．ここまでの操作でカルスは直径約3mmに膨潤する． ３．選抜用N6Dプレートに直径約3mmのカルスを置床する（プレート１枚あたり25個）．カルスの破片は置床しない． ４．30-33℃，14日間培養する（暗所，明所どちらでも構わない）． ●除菌が不充分でアグロバクテリウムが増殖する場合，カルスを滅菌水で５回，引き続きカルベニシリン溶液で５回洗浄し直すと除菌できる．ただし，この処理はアグロバクテリウムがコロニーを形成して１日以内でないと効果はない． ５．ビアラフォス選抜の場合は，選抜用N6Dプレート上で増殖したカルスの一部を次の選抜培地（カルベニシリン濃度を200mg/lに下げた選抜用N6Dプレート）に移植し（プレート１枚あたり16個），選抜を繰り返す．

7.2.6植物体の再分化NAA，カイネチン，選抜薬剤を含む再分化培地（ MS培地＋ビタミン類，ショ糖，ソルビトール，カザミノ酸）でカルスを培養し，植物体を再分化させる．再分化培地にはカルベニシリン（ 200mg/l）も含まれるが，アグロバクテリウムの増殖が認められる場合，カルスを新しいプレートに移植し直す．

［準備］再分化用プレート；ピンセット（滅菌済み）．

［実験方法］ １．再分化用プレートにカルスを移植する．プレートを４区画に分け，１区画に同一カルス由来のカルス5-7個を置床する． ●薬剤選抜中に増殖するカルスは小さい塊を形成する．これらの小さいカルス，あるいは薬剤選抜用プレートに置床したカルスから形成した大きい塊の淡黄色の部分を置床する． ２． 28-30℃，明所で7-14日間培養する（最長１ヶ月）．早いものでは培養３日目からカルスにグリーンのスポットが現れ，そこから植物体が再分化する．グリーンスポットをもつカルスが増えたら，１区画あたり５個程度残し，残りは除去する． ３．シュートが1-2 cmに伸長したら，発根用ホルモンフリー培地に移植する．再分化プレート上で根が伸長する場合もある．その場合，シュートと根を切らないように移植する． ４．再分化しなかった場合，カルスを100mg/lカルベニシリンを含む再分化プレートに移植し（プレート１枚あたり5-10個）， 28-30℃，明所で7-14日間培養する．

7.2.7ホルモンフリー培地による根の伸長促進と土壌への移植シュートが1-2 cmに伸びた再分化植物をホルモンを含まない培地（ホルモンフリー培地； MS培地＋ビタミン類，ショ糖）に移植し，根を伸長させる．再分化植物が充分に大きくなったら，空気（低湿度）に順化させたのち，土壌に移植する（鉢上げ）．ホルモンフリー培地で１ヶ月培養した個体も鉢上げする．

［準備］発根用ホルモンフリープレート；ピンセット（滅菌済み）．

［実験方法］ １．シュートが1-2 cmに伸びた再分化植物をホルモンフリープレートに移植する．通常単一のカルスから複数の植物体が再分化するので，まず再分化プレート上で植物を株分けする（シュートと根をもつ苗に分ける）．この時周囲のカルスをできるだけ除く．ホルモンフリープレートに小さな穴をあけ，株分けした苗を埋め込むように移植する．培養にともなってアルビノになるケースもあるので，同一カルス由来の苗をプレート１枚に2-3個体移植する． ２． 28-30℃，明所で2-3週間培養する（最長４週間）．生育が悪い場合，新しいプレートに植え替える． ３．シャーレ一杯に植物体が成長したら（草丈７～10 cm，根はプレートの底に展開する），シャーレの蓋をはずし水を張って，明所（10μmol photons m??s??以下；室内照明用蛍光灯程度の明るさ）に置き，植物体を３日間空気に順化させる． ４．流水あるいは水を張ったバットの中で培地を洗い落としながら再分化植物を株分けし，土壌に移植する．この時，シュート１個を１個体とする．移植後５日間程度は寒冷紗をかけ強光が当たらないようにする． ●順化処理を行っても鉢上げ後枯死する場合があるので，同一カルス由来の再分化植物を2-3個体移植し，新しい葉が展開したら間引きする． ●同一カルス由来であっても，株分けをせずに複数のシュートをまとめて移植するとキメラになる場合があるので，必ず株分けする．

参考文献 １) Y.Hiei, S.Ohta, T.Komari, &T.Kumashiro, Plant J. 6 (1994) P.271. ２) H.Rashid, S.Yokoi, K.Toriyama, &K.Hinata, Plant Cell Rep. 15 (1996) P.727. ３) S.Toki, Plant Mol.Biol.Rep. 15 (1997) P.16. ４)駒嶺穆，野村港二，「生物化学実験法41植物細胞工学入門」，学会出版センター，1998， P.311． ５)島本功，岡田清孝，「新版モデル植物の実験プロトコールﾁ?遺伝的手法からゲノム解析まで」，秀潤社， 2001，P.93． ６) S.Toki, N.Hara, K.Ono, H.Onodera, A.Tagiri, S. Oka, &H.Tanaka, Plant J. 47 (2006) P.969. ７)小川泰一，化学と生物38（ 2000）P.189．

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以下は表-------

表1：抗生物質・ホルモンストック溶液の調製試薬名・調製法濃度Carbenicillin 200mg/ml

Hygromycin B 50mg/ml

Bialaphos(明治製菓） 25mg/ml

Kanamycin 25mg/mlすべてMilli Q水（ DW）に溶解し，フィルター滅菌（ 0.22 μm）． 1mlずつ分注（ Bialaphosは200μlずつ）．－20℃保存． 2,4-D(2, 4-dichlorophenoxyacetic acid)(Sigma) 0.2 mg/ml 0.04gを10mlエタノール（99.5％）に溶解し， DWで200mlにメスアップ．４℃保存． Acetosyringone(Aldorich）100mg/ml DMSOで溶解．フィルター滅菌できないため，できるだけ無菌状態で調製． 50μlずつ分注，４℃遮光保存または－20℃保存． Kinetin 200μg/ml 20mgを5mlの1N NaOHに溶解し， DWで100mlにメスアップ．４℃保存． NAA(α-naphthaleneacetic acid） 200μg/ml 10mgを1mlの1N NaOHに溶解．溶液100μlをDWで5 mlにメスアップ．４℃保存． イネの形質転

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表2：植物用培地の調製カルス誘導，共存培養，薬剤選抜用培地N6D培地（カルス誘導用，薬剤選抜用）最終濃度試薬名・ストック溶液名1l ①3％ Sucrose 30g ②300mg/l?Casamino acids 300mg ③ 25mM Proline 2.9g ④ Chu N6 basal salt mixture(Sigma) １袋⑤ N6 Vitamin(×1000)?1ml ⑥ 2 mg/l 2,4-D(×100， 0.2 mg/ml）10ml ↓ 2 N KOHでpH5.8に調整し，１lにメスアップ． ⑦ 0.4％ Gelrite 4g ↓オートクレーブ選抜培地作製時は，約60℃に冷ましたのち抗生物質を添加300mg/l Carbenicillin(200mg/ml）1.5ml 50mg/l Hygromycin(50mg/ml）1mlまたは5mg/l Bialaphos(25mg/ml） 200μl 50mlずつ深型シャーレ(90×20mm）に分注．?ビアラフォス選抜の場合，カザミノ酸濃度は200mg/l．?N6 Vitaminストック溶液（×1000） 25 ml， Glycine 50 mg； Nicotinic acid12.5mg； Pyridoxine-HCl12.5mg； ThiamineHCl25mg； myo-Inositol2.5g．－20℃保存． 2N6-AS培地（共存培養用）最終濃度試薬名・ストック溶液名1l ①3％ Sucrose 30g ②300mg/l Casamino acids 300mg ③ Chu N6 basal salt mixture(SIGMA) 1袋④ N6 Vitamin(×1000）1ml ⑤ 2 mg/l 2,4-D(×100， 0.2 mg/ml）10ml ↓ 2 N KOHでpH5.2に調整し， 0.9lにメスアップ． ⑥ 0.4％ Gelrite 4g ↓オートクレーブ約60℃に冷ましたのち以下を添加． ⑦1％10％(w/v)D-(＋)-Glucose?100ml (オートクレーブ滅菌) ⑧10mg/l Acetosyringone(100mg/ml)100μl 50mlずつ深型シャーレ（ 90×20mm）に分注．?10％(w/v） D-(＋)-Glucose溶液：グルコースは溶けにくいので，攪拌しながら粉末を添加し，溶解する．

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再分化培地，発根用ホルモンフリー培地再分化培地最終濃度試薬名・ストック溶液名1l ①3％ Sucrose 30g ②3％ Sorbitol 30g ③ 2 g/l Casamino acids 2 g ④ MS Powder(Wako)1袋⑤ MS Vitamin(×1000)?1ml ⑥ 2 μg/l NAA(×10000， 200μg/ml)10μl ⑦ 2 mg/l Kinetin(×100， 200μg/ml)10ml ↓1N HClでpH5.8に調整し，1lにメスアップ． ⑧ 0.4％ Gelrite 4g ↓オートクレーブ約60℃に冷ましたのち抗生物質を添加． 100mg/l Carbenicillin(200mg/ml) 0.5ml 50mg/l Hygromycin(50mg/ml)1mlまたは5mg/l Bialaphos(25mg/ml) 200μl 50mlずつ深型シャーレ（90×20mm）に分注．?MS Vitaminストック溶液（ ×1000） 25ml， Glycine 50 mg； Nicotinic acid 12.5 mg； Pyridoxine-HCl 12. 5 mg； Thiamine-HCl 2.5mg； myo-Inositol 2.5g．－20℃保存．発根用ホルモンフリー培地最終濃度試薬名・ストック溶液名1l ①３％ Sucrose 30g ② MS powder （ Wako）1袋③ MS Vitamin （ ×1000）1ml ↓ 2 N KOHでpH5.8に調整し，1lにメスアップ． ↓オートクレーブ約60℃に冷ましたのち抗生物質を添加． 50mg/l Hygromycin(50mg/ml）1mlまたは5mg/l Bialaphos(25mg/ml） 200 μl 50mlずつ深型シャーレ（90×20mm）に分注．

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表3：アグロバクテリウム用培地の調製AB培地（アグロバクテリウム培養用）最終濃度試薬名・ストック溶液名1l ①3g/l K?HPO?3g ②1.3g/l NaH?PO?･2 H?O 1.3g ③1g/l NH?Cl 1g ④ 0.15g/l KCl 0.15g ⑤10mg/l CaCl?･2 H?O 10mg ⑥ 2.5mg/l 25mg/ml FeSO?･7H?O(用時調製) 100μl ↓ 2 N KOHでpH7.2に調整し， 0.9lにメスアップ． ↓300mlの三角フラスコに180mlずつ分注． ⑦1.5％ Bacto agar 3g/180ml ↓オートクレーブ約60℃に冷ましたのち以下を添加． ⑧ 0.5％ 5％(w/v)D-(＋)-Glucose 20ml (オートクレーブ滅菌) ⑨1.2 mM 1M MgSO?･7H?O 240μl (オートクレーブ滅菌) ⑩ 50mg/l Kanamycin(25mg/ml）400μlハイグロマイシン選抜の場合50mg/l Hygromycin(50mg/ml） 200μlビアラフォス選抜の場合，選抜薬剤は添加しない．約20 mlずつ薄型シャーレ（90×15mm）に分注． AAM培地（アグロバクテリウム感染用）ストック溶液の組成１． AA-1ストック溶液（×1000)100ml次の順に溶解させる． KI 75mg； CoCl?･6H?O 2.5 mg； CuSO?･5H?O 2.5mg； Na?MoO?･2 H?O 25 mg； ZnSO?･4H?O 0.2 g； MnSO?･6H?O 1g． ２． AA-2ストック溶液（×1000）100ml

CaCl?･2 H?O 15g ３． AA-3ストック溶液（×1000）100ml

MgSO?･7H?O 25g ４． Fe-EDTAストック溶液（ ×1000）100ml

Fe-EDTA 4g ５． AA-5ストック溶液（×1000）100ml

NaH?PO?･2 H?O 15g ６． AA-Solストック溶液（×100）100ml

L-Arginine 1.77g

Glycine 75mg ７． AA-KClストック溶液（×50）100ml

KCl 15g ８． AA-6 Vitaminストック溶液(×1000)10ml

Nicotinic acid 10mg； Pyridoxine-HCl 10mg； Thiamine-HCl 0.1g； myo-Inositol 1g． AA-6 Vitaminは－20℃保存．それ以外は４℃保存．

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AAM培地最終濃度試薬名・ストック溶液名1l ① 0.3g/l L-Aspartic acid?0.3g ② AA-1(×1000）1ml ③ AA-2(×1000）1ml ④ AA-3(×1000）1ml ⑤ Fe-EDTA(×1000）1ml ⑥ AA-5(×1000）1ml ⑦ AA-6 Vitamin(×1000）1ml ⑧ AA-Sol(×100）10ml ⑨ AA-KCl(×50） 20ml ⑩ 0.5g/l Casamino acids 0.5g??6.85％ Sucrose 68.5g??0.9g/l L-Glutamine 0.9g ↓2 N KOHでpH5.2に調整し， 0.9Lにメスアップ． ↓オートクレーブ室温に冷ましたのちグルコース溶液を添加．??3.6％36％(w/v)D-(＋)-Glucose 100ml （オートクレーブ滅菌） 100ml三角フラスコに90mlずつ分注し，４℃保存．?L-Aspartic acidは溶解しにくいので最初に加える．

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表は以上-------