PlantBiotech:Species/Lotus japonicus/Media

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: を1000mlの水に溶かす。
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: 寒天1.5gを200mlメジューム瓶にとり、YEPを100mlずつ分注。
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:寒天1.5gを200mlメジューム瓶にとり、YEPを100mlずつ分注。
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: オートクレーブして、室温に保存。
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: 使用に際して、電子レンジで溶かす。
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: 60℃程度に冷えてから、必要な抗生物質を加える。
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: クリーンベンチ内で、9cmプレート6-8枚に注いで固める。
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| Mannitol || 1.0g
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: を500mlの水に溶かし、100mlずつに分注してオートクレーブ、室温に保存。
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:を500mlの水に溶かし、100mlずつに分注してオートクレーブ、室温に保存。
  
  
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: 用事、1mlの0.3Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）を加える。
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:用事、1mlの0.3Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）を加える。
 
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| colspan="2" | 0.3M K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>/KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> (pH6.8)
 
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| K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> || 2.59g
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: を水にとかし100mlとする。オートクレーブ。
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:を水にとかし100mlとする。オートクレーブ。
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<sup>（注１）</sup> LB培地でも可。
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(1/10 B5, BAP 0.5μg/ml, NAA 0.05μg/ml, MES5.2 5mM, Acetosyringone 20μg/ml)
 
(1/10 B5, BAP 0.5μg/ml, NAA 0.05μg/ml, MES5.2 5mM, Acetosyringone 20μg/ml)
  
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: B5 basal salts (Wako: #399-00621) 0.33 g を1000mlの水に溶かす。
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:B5 basal salts (Wako: #399-00621) 0.33 g を1000mlの水に溶かす。
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: 250mlボトルに200mlずつ分注し、オートクレーブ、室温保存(1/10　B5)。
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:250mlボトルに200mlずつ分注し、オートクレーブ、室温保存(1/10　B5)。
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: 使用時、次のものを加える。
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| 1000x Vitamin stock || 20μl || (0.1x)
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====Callus培地およびShoot Induction培地====
 
====Callus培地およびShoot Induction培地====
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| B5 basal salts || 1.66g
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| sucrose || 10g
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: を500mlの水に溶かす。
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:を500mlの水に溶かす。
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: 1N NaOHでpH5.5に調整する。
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:1N NaOHでpH5.5に調整する。
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: 1.5gのphytagelを加えてオートクレーブ。
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:1.5gのphytagelを加えてオートクレーブ。
  
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: 熱いうちに
+
:熱いうちに
 
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| 4M (NH4)2SO4 || 625μl || (10mM NH<sub>4</sub><sup>+</sup>)
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: を加える。
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:を加える。
  
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: 70℃以下に冷やしてから、次のものを加える。
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:70℃以下に冷やしてから、次のものを加える。
 
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| 1000x Vitamin stock || 500μl || (1x)
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| NAA　(1mg/ml) || 25μl || (0.05μg/ml)
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| BAP (1mg/ml) || 250μl || (0.5μg/ml)<sup>（注２）</sup>
+
| BAP (1mg/ml) || 250 μl || (0.5μg/ml) <ref>GifuではBAP濃度1.0μg/mlの方がよい場合がある。しかし、MG20はBAPに弱いので、カルス培地、再分化培地ともに、0.2μg/mlがよい。</ref>
 
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−
| cefotaxime (30mg/ml) || 5ml || (300μg/ml)
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| cefotaxime (30mg/ml) || 5 ml || (300μg/ml)
 
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: Selection<sup>（注３）</sup>
+
:Selection <ref>Selectionのための最適な抗生物質濃度は、実験的に決める。特にHygromycinは純度が低く一定しないのでロットごとにkill-curveを作って確認する必要がある。Shoot inductionでのselectionはオプションである。カルス培地で5週以上のselectionが行われていれば、shoot inductionは抗生物質なしでよい。あるいは最初の2週だけselectionを続けてもよい（Stiller et al., 1997）。抗生物質の存在は、多かれ少なかれ再分化を遅らせ,再生効率を低下させる。</ref>
 
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| G418 (50mg/ml) || 100-200μl/500ml || (10-20μg/ml)
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| G418 (50mg/ml) || 100-200 μl/500ml || (10-20μg/ml)
 
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| HygromycinB (10mg/ml) || 0.75-2ml/500ml || (15-40μg/ml)
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====Shoot Elongation培地====
 
====Shoot Elongation培地====
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(1x B5, 2% sucrose, BAP 0.2μg/ml, 0.3% phytagel)
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(1x B5, 2% sucrose, BAP 0.2 μg/ml, 0.3 % phytagel)
 
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| B5 basal salts || 1.66g
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: を500mlの水に溶かす。
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:を500mlの水に溶かす。
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: 1N NaOH　でpH5.5に調整する。
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:1N NaOH　でpH5.5に調整する。
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: 1.5gのphytagelを加えてオートクレーブ。
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:1.5gのphytagelを加えてオートクレーブ。
  
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: 70℃以下に冷やしてから、次のものを加える。
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| 1000x Vitamin stock || 500μl || (1x)
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| cefotaxime (30mg/ml) || 2.5ml || (150μg/ml)
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| B5 basal salts || 0.83g
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: を500 mlの水に溶かす。
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:を500 mlの水に溶かす。
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: 1N NaOH　でpH5.5に調整する。
+
:1N NaOH　でpH5.5に調整する。
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: 2.0gのphytagelを加えてオートクレーブ。
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:2.0gのphytagelを加えてオートクレーブ。
  
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: 70oC以下に冷やしてから、次のものを加える。
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| 1000x Vitamin stock || 250μl || (0.5x)
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| B5 basal salts || 0.83g
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| sucrose || 5g
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: を500 mlの水に溶かす。
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:を500 mlの水に溶かす。
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: 1N NaOH　でpH5.5に調整する。
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:1N NaOH　でpH5.5に調整する。
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: 2.0gのphytagelを加えてオートクレーブ。
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:2.0gのphytagelを加えてオートクレーブ。
  
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: 70oC以下に冷やしてから、次のものを加える。
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:70oC以下に冷やしてから、次のものを加える。
 
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| 1000x Vitamin stock || 250μl || (0.5x)
+
| 1000x Vitamin stock || 250 μl || (0.5x)
 
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|}
−
: <sup>（注２）</sup>GifuではBAP濃度1.0μg/mlの方がよい場合がある。しかし、MG20はBAPに弱いので、カルス培地、再分化培地ともに、0.2μg/mlがよい。
 
  
−
: <sup>（注３）</sup>Selectionのための最適な抗生物質濃度は、実験的に決める。特にHygromycinは純度が低く一定しないのでロットごとにkill-curveを作って確認する必要がある。Shoot inductionでのselectionはオプションである。カルス培地で5週以上のselectionが行われていれば、shoot inductionは抗生物質なしでよい。あるいは最初の2週だけselectionを続けてもよい（Stiller et al., 1997）。抗生物質の存在は、多かれ少なかれ再分化を遅らせ,再生効率を低下させる。
+
;注釈
 +
<references/>
  
−
: Kill-curveの作り方：
+
;Kill-curveの作り方
−
: バイナリベクターを含まないAgrobacteriumを用いて形質転換と同じ操作を行い、3週間の選抜で100%の胚軸切片を殺す最小の抗生物質濃度を決める。Stougaardによればこの最小濃度の2倍を用いる。しかし、Stillerらはこの最小濃度を用いている。我々の経験では、カルス培地でのselectionは最小濃度の4-6培とやや高い濃度で行い、再分化培地ではselectionを行わないのがよい。この場合いくらかescapeが出ることは避けられないが、全体としてよい結果が得られる。目安となる濃度は、Hygromycinが40μg/ml、G418では25μg/ml。
+
:バイナリベクターを含まないAgrobacteriumを用いて形質転換と同じ操作を行い、3週間の選抜で100%の胚軸切片を殺す最小の抗生物質濃度を決める。Stougaardによればこの最小濃度の2倍を用いる。しかし、Stillerらはこの最小濃度を用いている。我々の経験では、カルス培地でのselectionは最小濃度の4-6培とやや高い濃度で行い、再分化培地ではselectionを行わないのがよい。この場合いくらかescapeが出ることは避けられないが、全体としてよい結果が得られる。目安となる濃度は、Hygromycinが40μg/ml、G418では25μg/ml。

Latest revision as of 15:28, 2 September 2011

Contents

[edit] アグロバクテリウム用培地

[edit] YEP寒天培地

[1]

YE 10 g
Peptone 10 g
NaCl 5 g
を1000mlの水に溶かす。
寒天1.5gを200mlメジューム瓶にとり、YEPを100mlずつ分注。
オートクレーブして、室温に保存。
使用に際して、電子レンジで溶かす。
60℃程度に冷えてから、必要な抗生物質を加える。
Kanamycin 100 μg/ml
Tetracyclin 5 μg/ml
Rifampicin 100 μg/ml
Spectinomycin 100 μg/ml
Carbenicilin 100 μg/ml
Gentamycin 100 μg/ml
クリーンベンチ内で、9cmプレート6-8枚に注いで固める。


[edit] YMB液体培地

Mannitol 1.0 g
YE 0.2 g
MgSO4.7H2O 0.1 g
NaCl 0.05 g
を500mlの水に溶かし、100mlずつに分注してオートクレーブ、室温に保存。


用事、1mlの0.3Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）を加える。
0.3M K2HPO4/KH2PO4 (pH6.8)
K2HPO4 2.59 g
KH2PO4 2.05 g
を水にとかし100mlとする。オートクレーブ。


[edit] 植物用培地

[edit] Co-cultivation培地

(1/10 B5, BAP 0.5μg/ml, NAA 0.05μg/ml, MES5.2 5mM, Acetosyringone 20μg/ml)

B5 basal salts (Wako: #399-00621) 0.33 g を1000mlの水に溶かす。
250mlボトルに200mlずつ分注し、オートクレーブ、室温保存(1/10　B5)。
使用時、次のものを加える。
1000x Vitamin stock 20 μl (0.1x)
NAA　(1mg/ml) 10 μl (0.05 μg/ml)
BAP (1mg/ml) 100 μl (0.5 μg/ml)
1M MES (pH5.2) 1.00 ml (5 mM)
Acetosyringone (20mg/ml) 200 μl (20 μg/ml)

[edit] Callus培地およびShoot Induction培地

(1x B5, 2% sucrose, BAP 0.5μg/ml, NAA 0.05μg/ml, 10mM NH4, 0.3% phytagel)

B5 basal salts 1.66 g
sucrose 10 g
を500mlの水に溶かす。
1N NaOHでpH5.5に調整する。
1.5gのphytagelを加えてオートクレーブ。
熱いうちに
4M (NH4)2SO4 625 μl (10mM NH4+)
を加える。
70℃以下に冷やしてから、次のものを加える。
1000x Vitamin stock 500 μl (1x)
NAA　(1mg/ml) 25 μl (0.05μg/ml)
BAP (1mg/ml) 250 μl (0.5μg/ml) [2]
cefotaxime (30mg/ml) 5 ml (300μg/ml)
Selection [3]
G418 (50mg/ml) 100-200 μl/500ml (10-20μg/ml)
HygromycinB (10mg/ml) 0.75-2 ml/500ml (15-40μg/ml)

[edit] Shoot Elongation培地

(1x B5, 2% sucrose, BAP 0.2 μg/ml, 0.3 % phytagel)

B5 basal salts 1.66 g
sucrose 10 g
を500mlの水に溶かす。
1N NaOH　でpH5.5に調整する。
1.5gのphytagelを加えてオートクレーブ。
70℃以下に冷やしてから、次のものを加える。
1000x Vitamin stock 500 μl (1x)
BAP stock (1mg/ml) 100 μl (0.2μg/ml)
cefotaxime (30mg/ml) 2.5 ml (150μg/ml)


[edit] Root induction培地

(1/2 B5, 1% sucrose, 0.5μg/ml NAA, 0.4% phytagel)

B5 basal salts 0.83 g
sucrose 5 g
を500 mlの水に溶かす。
1N NaOH　でpH5.5に調整する。
2.0gのphytagelを加えてオートクレーブ。
70oC以下に冷やしてから、次のものを加える。
1000x Vitamin stock 250 μl (0.5x)
NAA stock (1mg/ml) 250 μl (0.5μg/ml)


[edit] Root Elongation培地

(1/2 B5, 1% sucrose)

B5 basal salts 0.83 g
sucrose 5 g
を500 mlの水に溶かす。
1N NaOH　でpH5.5に調整する。
2.0gのphytagelを加えてオートクレーブ。
70oC以下に冷やしてから、次のものを加える。
1000x Vitamin stock 250 μl (0.5x)
注釈
  1. ↑ LB培地でも可。
  2. ↑ GifuではBAP濃度1.0μg/mlの方がよい場合がある。しかし、MG20はBAPに弱いので、カルス培地、再分化培地ともに、0.2μg/mlがよい。
  3. ↑ Selectionのための最適な抗生物質濃度は、実験的に決める。特にHygromycinは純度が低く一定しないのでロットごとにkill-curveを作って確認する必要がある。Shoot inductionでのselectionはオプションである。カルス培地で5週以上のselectionが行われていれば、shoot inductionは抗生物質なしでよい。あるいは最初の2週だけselectionを続けてもよい（Stiller et al., 1997）。抗生物質の存在は、多かれ少なかれ再分化を遅らせ,再生効率を低下させる。
Kill-curveの作り方
バイナリベクターを含まないAgrobacteriumを用いて形質転換と同じ操作を行い、3週間の選抜で100%の胚軸切片を殺す最小の抗生物質濃度を決める。Stougaardによればこの最小濃度の2倍を用いる。しかし、Stillerらはこの最小濃度を用いている。我々の経験では、カルス培地でのselectionは最小濃度の4-6培とやや高い濃度で行い、再分化培地ではselectionを行わないのがよい。この場合いくらかescapeが出ることは避けられないが、全体としてよい結果が得られる。目安となる濃度は、Hygromycinが40μg/ml、G418では25μg/ml。
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