PlantBiotech:Species/Lotus japonicus/Media
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Revision as of 15:27, 2 September 2011
Contents |
アグロバクテリウム用培地
YEP寒天培地
| YE | 10 g |
| Peptone | 10 g |
| NaCl | 5 g |
- を1000mlの水に溶かす。
- 寒天1.5gを200mlメジューム瓶にとり、YEPを100mlずつ分注。
- オートクレーブして、室温に保存。
- 使用に際して、電子レンジで溶かす。
- 60℃程度に冷えてから、必要な抗生物質を加える。
| Kanamycin | 100 μg/ml |
| Tetracyclin | 5 μg/ml |
| Rifampicin | 100 μg/ml |
| Spectinomycin | 100 μg/ml |
| Carbenicilin | 100 μg/ml |
| Gentamycin | 100 μg/ml |
- クリーンベンチ内で、9cmプレート6-8枚に注いで固める。
YMB液体培地
| Mannitol | 1.0 g |
| YE | 0.2 g |
| MgSO4.7H2O | 0.1 g |
| NaCl | 0.05 g |
- を500mlの水に溶かし、100mlずつに分注してオートクレーブ、室温に保存。
- 用事、1mlの0.3Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）を加える。
| 0.3M K2HPO4/KH2PO4 (pH6.8) | |
| K2HPO4 | 2.59 g |
| KH2PO4 | 2.05 g |
- を水にとかし100mlとする。オートクレーブ。
植物用培地
Co-cultivation培地
(1/10 B5, BAP 0.5μg/ml, NAA 0.05μg/ml, MES5.2 5mM, Acetosyringone 20μg/ml)
- B5 basal salts (Wako: #399-00621) 0.33 g を1000mlの水に溶かす。
- 250mlボトルに200mlずつ分注し、オートクレーブ、室温保存(1/10 B5)。
- 使用時、次のものを加える。
| 1000x Vitamin stock | 20 μl | (0.1x) |
| NAA (1mg/ml) | 10 μl | (0.05 μg/ml) |
| BAP (1mg/ml) | 100 μl | (0.5 μg/ml) |
| 1M MES (pH5.2) | 1.00 ml | (5 mM) |
| Acetosyringone (20mg/ml) | 200 μl | (20 μg/ml) |
Callus培地およびShoot Induction培地
(1x B5, 2% sucrose, BAP 0.5μg/ml, NAA 0.05μg/ml, 10mM NH4, 0.3% phytagel)
| B5 basal salts | 1.66 g |
| sucrose | 10 g |
- を500mlの水に溶かす。
- 1N NaOHでpH5.5に調整する。
- 1.5gのphytagelを加えてオートクレーブ。
熱いうちに
| 4M (NH4)2SO4 | 625 μl | (10mM NH4+) |
- を加える。
- 70℃以下に冷やしてから、次のものを加える。
| 1000x Vitamin stock | 500 μl | (1x) |
| NAA (1mg/ml) | 25 μl | (0.05μg/ml) |
| BAP (1mg/ml) | 250 μl | (0.5μg/ml) [2] |
| cefotaxime (30mg/ml) | 5 ml | (300μg/ml) |
- Selection [3]
| G418 (50mg/ml) | 100-200 μl/500ml | (10-20μg/ml) |
| HygromycinB (10mg/ml) | 0.75-2 ml/500ml | (15-40μg/ml) |
Shoot Elongation培地
(1x B5, 2% sucrose, BAP 0.2 μg/ml, 0.3 % phytagel)
| B5 basal salts | 1.66 g |
| sucrose | 10 g |
- を500mlの水に溶かす。
- 1N NaOH でpH5.5に調整する。
- 1.5gのphytagelを加えてオートクレーブ。
- 70℃以下に冷やしてから、次のものを加える。
| 1000x Vitamin stock | 500 μl | (1x) |
| BAP stock (1mg/ml) | 100 μl | (0.2μg/ml) |
| cefotaxime (30mg/ml) | 2.5 ml | (150μg/ml) |
Root induction培地
(1/2 B5, 1% sucrose, 0.5μg/ml NAA, 0.4% phytagel)
| B5 basal salts | 0.83 g |
| sucrose | 5 g |
- を500 mlの水に溶かす。
- 1N NaOH でpH5.5に調整する。
- 2.0gのphytagelを加えてオートクレーブ。
- 70oC以下に冷やしてから、次のものを加える。
| 1000x Vitamin stock | 250 μl | (0.5x) |
| NAA stock (1mg/ml) | 250 μl | (0.5μg/ml) |
Root Elongation培地
(1/2 B5, 1% sucrose)
| B5 basal salts | 0.83 g |
| sucrose | 5 g |
- を500 mlの水に溶かす。
- 1N NaOH でpH5.5に調整する。
- 2.0gのphytagelを加えてオートクレーブ。
- 70oC以下に冷やしてから、次のものを加える。
| 1000x Vitamin stock | 250 μl | (0.5x) |
- 注釈
- ↑ LB培地でも可。
- ↑ GifuではBAP濃度1.0μg/mlの方がよい場合がある。しかし、MG20はBAPに弱いので、カルス培地、再分化培地ともに、0.2μg/mlがよい。
- ↑ Selectionのための最適な抗生物質濃度は、実験的に決める。特にHygromycinは純度が低く一定しないのでロットごとにkill-curveを作って確認する必要がある。Shoot inductionでのselectionはオプションである。カルス培地で5週以上のselectionが行われていれば、shoot inductionは抗生物質なしでよい。あるいは最初の2週だけselectionを続けてもよい（Stiller et al., 1997）。抗生物質の存在は、多かれ少なかれ再分化を遅らせ,再生効率を低下させる。
- Kill-curveの作り方
- バイナリベクターを含まないAgrobacteriumを用いて形質転換と同じ操作を行い、3週間の選抜で100%の胚軸切片を殺す最小の抗生物質濃度を決める。Stougaardによればこの最小濃度の2倍を用いる。しかし、Stillerらはこの最小濃度を用いている。我々の経験では、カルス培地でのselectionは最小濃度の4-6培とやや高い濃度で行い、再分化培地ではselectionを行わないのがよい。この場合いくらかescapeが出ることは避けられないが、全体としてよい結果が得られる。目安となる濃度は、Hygromycinが40μg/ml、G418では25μg/ml。
