PlantBiotech:Species/Lotus japonicus
From Metabolomics.JP
試薬
- B5 Vitamin (1000x)
- B5 Vitamin Stock (Sigma: #G1019) 1000x
- 滅菌済みだが、0.22μm メンブレンフィルターで濾過し、1mlずつ分注して-20℃に保存。
- フィルター滅菌には、注射器とDISMIC (ADVANTEC, 0.22μm)などを用いる(作業はクリーンベンチ内)。以下同様。
- 1M MES pH5.2
- MES 21.3g を約80mlの滅菌水に溶かす。
- 1M NaOHでpH 5.2とし、100mlに定容する。
- フィルター滅菌し、1.5mlずつに分注して-20℃に保存。
- BAP (1mg/ml)
- BAP (Sigma: #B-9395) 50mgを1mlの1M NaOHに溶かし、滅菌水で50mlとする。
- フィルター滅菌し、1mlずつに分注して-20℃に保存。
- または、BAP solution (Sigma: #B3274, 1mg/ml)をフィルター滅菌し、1mlずつに分注。
- NAA (1mg/ml)
- NAA (Sigma; #N-0640) 50mg を24mlの95% EtOHに溶かし、滅菌水で50mlとする。
- またはNAA solution (Sigma: N1641, 1mg/ml)。
- フィルター滅菌し、1mlずつに分注して-20℃に保存。
- 4M (NH4)22SO4
- (NH4)22SO4 26.4g を50mlの滅菌水に溶かす。
- フィルター滅菌し、1.5mlずつに分注して-20℃に保存。
- G418 (50mg/ml)
- Geneticine solution (Sigma #G-7014, 50mg/ml)
- フィルター滅菌し、1mlずつに分注して-20℃に保存。
- Hygromycin B (10mg/ml)
- Hygromycin B (Sigma: #H-9773) 250mg を16mlの滅菌水に溶かす。(純度は通常70%くらい。ロットにより違う)
- フィルター滅菌し、1mlずつに分注して-20℃に保存。
- またはHygromycin B solution (Sigma: H5527, 50mg/ml)を用いる(純度は50%以上)。
- Cefotaxime (30mg/ml)
- Cefotaxime (Sigma: #C-7912) 3 g を100mlの滅菌水に溶かす。
- フィルター滅菌し、10mlずつ#2059に分注して-20℃に保存。
- Acetosyringone (20mg/ml)
- Acetosyringone (Aldrich #D134406) をDMSOに20mg/mlになるように溶かす。
- フィルター滅菌し、1mlずつに分注して-20℃に保存。
アグロバクテリウム用培地
- YEP寒天培地(注1)
YE | 10g |
Peptone | 10g |
NaCl | 5g |
- を1000mlの水に溶かす。
- 寒天1.5gを200mlメジューム瓶にとり、YEPを100mlずつ分注。
- オートクレーブして、室温に保存。
- 使用に際して、電子レンジで溶かす。
- 60℃程度に冷えてから、必要な抗生物質を加える。
Kanamycin | 100μg/ml |
Tetracyclin | 5μg/ml |
Rifampicin | 100μg/ml |
Spectinomycin | 100μg/ml |
Carbenicilin | 100μg/ml |
Gentamycin | 100μg/ml |
- クリーンベンチ内で、9cmプレート6-8枚に注いで固める。
- YMB液体培地
Mannitol | 1.0g |
YE | 0.2g |
MgSO4.7H2O | 0.1g |
NaCl | 0.05g |
- を500mlの水に溶かし、100mlずつに分注してオートクレーブ、室温に保存。
- 用事、1mlの0.3Mリン酸カリウム緩衝液(pH6.8)を加える。
0.3M K2HPO4/KH2PO4 (pH6.8) | |
K2HPO4 | 2.59g |
KH2PO4 | 2.05g |
- を水にとかし100mlとする。オートクレーブ。
(注1) LB培地でも可。
植物用培地
- Co-cultivation培地
- (1/10 B5, BAP 0.5μg/ml, NAA 0.05μg/ml, MES5.2 5mM, Acetosyringone 20μg/ml)
- B5 basal salts (Wako: #399-00621) 0.33 g を1000mlの水に溶かす。
- 250mlボトルに200mlずつ分注し、オートクレーブ、室温保存(1/10 B5)。
- 使用時、次のものを加える。
1000x Vitamin stock | 20μl | (0.1x) |
NAA (1mg/ml) | 10μl | (0.05μg/ml) |
BAP (1mg/ml) | 100μl | (0.5μg/ml) |
1M MES (pH5.2) | 1.00ml (5mM) | |
Acetosyringone (20mg/ml) | 200μl | (20μg/ml) |
- Callus培地およびShoot Induction培地
- (1x B5, 2% sucrose, BAP 0.5μg/ml, NAA 0.05μg/ml, 10mM NH4, 0.3% phytagel)
B5 basal salts | 1.66g |
sucrose | 10g |
- を500mlの水に溶かす。
- 1N NaOHでpH5.5に調整する。
- 1.5gのphytagelを加えてオートクレーブ。
- 熱いうちに
4M (NH4)2SO4 | 625μl | (10mM NH4+) |
- を加える。
- 70℃以下に冷やしてから、次のものを加える。
1000x Vitamin stock | 500μl | (1x) |
NAA (1mg/ml) | 25μl | (0.05μg/ml) |
BAP (1mg/ml) | 250μl | (0.5μg/ml)(注2) |
cefotaxime (30mg/ml) | 5ml | (300μg/ml) |
- Selection(注3)
G418 (50mg/ml) | 100-200μl/500ml | (10-20μg/ml) |
HygromycinB (10mg/ml) | 0.75-2ml/500ml | (15-40μg/ml) |
- Shoot Elongation培地
- (1x B5, 2% sucrose, BAP 0.2μg/ml, 0.3% phytagel)
B5 basal salts | 1.66g |
sucrose | 10g |
- を500mlの水に溶かす。
- 1N NaOH でpH5.5に調整する。
- 1.5gのphytagelを加えてオートクレーブ。
- 70℃以下に冷やしてから、次のものを加える。
1000x Vitamin stock | 500μl | (1x) |
BAP stock (1mg/ml) | 100μl | (0.2μg/ml) |
cefotaxime (30mg/ml) | 2.5ml | (150μg/ml) |