PlantBiotech:Species/Oryza sativa/Media
From Metabolomics.JP
Contents |
植物用培地の調整
N6D培地（カルス誘導用，薬剤選抜用）
| 最終濃度 | 試薬名・ストック溶液名 | 1l |
|---|---|---|
| ① 3％ | Sucrose | 30g |
| ② 300mg/la | Casamino acids | 300mg |
| ③ 25mM | Proline | 2.9g |
| ④ | Chu N6 basal salt mixture (Sigma) | １袋 |
| ⑤ | N6 Vitamin (×1000)b | 1ml |
| ⑥ 2mg/l | 2,4-D (×100， 0.2mg/ml) | 10ml |
| ↓ 2N KOHでpH5.8に調整し，１lにメスアップ | ||
| ⑦ 0.4％ | Gelrite） | 4g |
| ↓オートクレーブ | ||
| 選抜培地作製時は，約60℃に冷ましたのち抗生物質を添加。 | ||
| 300mg/l | Carbenicillin (200mg/ml） | 1.5ml |
| 50mg/l | Hygromycin (50mg/ml） | 1ml |
| または | ||
| 5mg/l | Bialaphos (25mg/ml） | 200μl |
| 50mlずつ深型シャーレ(90×20mm）に分注。 | ||
- a ビアラフォス選抜の場合，カザミノ酸濃度は200mg/l。
- b N6 Vitaminストック溶液（×1000） 25ml，Glycine50mg；Nicotinic acid12.5mg；Pyridoxine-HCl12.5mg；ThiamineHCl25mg；myo-Inositol2.5g, －20℃保存。
2N6-AS培地（共存培養用）
| 最終濃度 | 試薬名・ストック溶液名 | 1l |
|---|---|---|
| ①3％ | Sucrose | 30g |
| ②300mg/l | Casamino acids | 300mg |
| ③ | Chu N6 basal salt mixture(SIGMA) | 1袋 |
| ④ | N6 Vitamin(×1000) | 1ml |
| ⑤ 2mg/l | 2,4-D(×100， 0.2mg/ml） | 10ml |
| ↓ 2N KOHでpH5.2に調整し， 0.9lにメスアップ。 | ||
| ⑥ 0.4％ | Gelrite | 4g |
| ↓ オートクレーブ約60℃に冷ましたのち以下を添加。 | ||
| ⑦1％ | 10％(w/v)D-(＋)-Glucosec(オートクレーブ滅菌) | 100ml |
| ⑧10mg/l | Acetosyringone(100mg/ml) | 100μl |
| 50mlずつ深型シャーレ（ 90×20mm）に分注。 | ||
- c 10％(w/v）D-(＋)-Glucose溶液：グルコースは溶けにくいので，攪拌しながら粉末を添加し，溶解する。
再分化培地
| 最終濃度 | 試薬名・ストック溶液名 | 1l |
|---|---|---|
| ①3％ | Sucrose | 30g |
| ②3％ | Sorbitol | 30g |
| ③ 2g/l | Casamino acids | 2g |
| ④ | MS Powder(Wako) | 1袋 |
| ⑤ | MS Vitamin(×1000)d | 1ml |
| ⑥ 2μg/l | NAA(×10000， 200μg/ml) | 10μl |
| ⑦ 2mg/l | Kinetin(×100， 200μg/ml) | 10ml |
| ↓ 1N HClでpH5.8に調整し，1lにメスアップ。 | ||
| ⑧ 0.4％ | Gelrite | 4g |
| ↓ オートクレーブ約60℃に冷ましたのち抗生物質を添加。 | ||
| 100mg/l | Carbenicillin(200mg/ml) | 0.5ml |
| 50mg/l | Hygromycin(50mg/ml) | 1ml |
| または | ||
| 5mg/l | Bialaphos(25mg/ml) | 200μl |
| 50mlずつ深型シャーレ（90×20mm）に分注。 | ||
- d MS Vitaminストック溶液（ ×1000） 25ml，Glycine50mg；Nicotinic acid12.5mg；Pyridoxine-HCl12.5mg；Thiamine-HCl2.5mg；myo-Inositol2.5g, －20℃保存。
発根用ホルモンフリー培地
| 最終濃度 | 試薬名・ストック溶液名 | 1l |
|---|---|---|
| ①3％ | Sucrose | 30g |
| ② | MS powder（Wako） | 1袋 |
| ③ | MS Vitamin（×1000） | 1ml |
| ↓ 2N KOHでpH5.8に調整し，1lにメスアップ。 | ||
| ↓ オートクレーブ約60℃に冷ましたのち抗生物質を添加。 | ||
| 50mg/l | Hygromycin(50mg/ml） | 1ml |
| または | ||
| 5mg/l | Bialaphos(25mg/ml） | 200μl |
| 50mlずつ深型シャーレ（90×20mm）に分注。 | ||
アグロバクテリウム用培地の調製
AB培地（アグロバクテリウム培養用）
| 最終濃度 | 試薬名・ストック溶液名 | 1l |
|---|---|---|
| ①3g/l | K2HPO4 | 3g |
| ②1.3g/l | NaH2PO4･2H2O | 1.3g |
| ③1g/l | NH4Cl | 1g |
| ④ 0.15g/l | KCl | 0.15g |
| ⑤10mg/l | CaCl2･2H2O | 10mg |
| ⑥ 2.5mg/l | 25mg/ml FeSO4･7H2O(用時調製) | 100μl |
| ↓ 2N KOHでpH7.2に調整し， 0.9lにメスアップ。 | ||
| ↓ 300mlの三角フラスコに180mlずつ分注。 | ||
| ⑦1.5％ | Bacto agar | 3g/180ml |
| ↓ オートクレーブ | ||
| 約60℃に冷ましたのち以下を添加。 | ||
| ⑧ 0.5％ | 5％(w/v)D-(＋)-Glucose (オートクレーブ滅菌) | 20ml |
| ⑨1.2mM | 1M MgSO4･7H2O (オートクレーブ滅菌) | 240μl |
| ⑩ 50mg/l | Kanamycin(25mg/ml） | 400μl |
| ハイグロマイシン選抜の場合 | ||
| 50mg/l | Hygromycin(50mg/ml） | 200μl |
| ビアラフォス選抜の場合，選抜薬剤は添加しない。 | ||
| 約20mlずつ薄型シャーレ（90×15mm）に分注。 | ||
AAM培地（アグロバクテリウム感染用）ストック溶液の組成
| １． | AA-1ストック溶液（×1000） | 100ml |
| 次の順に溶解させる。KI 75mg；CoCl2･6H2O 2.5mg；CuSO4･5H2O 2.5mg；Na2MoO4･2H2O 25mg；ZnSO4･4H2O 0.2g；MnSO4･6H2O 1g | ||
| ２． | AA-2ストック溶液（×1000） | 100ml |
| CaCl2･2H2O 15g | ||
| ３． | AA-3ストック溶液（×1000） | 100ml |
| MgSO4･7H2O 25g | ||
| ４． | Fe-EDTAストック溶液（ ×1000） | 100ml |
| Fe-EDTA 4g | ||
| ５． | AA-5ストック溶液（×1000） | 100ml |
| NaH2PO4･2H2O 15g | ||
| ６． | AA-Solストック溶液（×100） | 100ml |
| L-Arginine 1.77g；Glycine 75mg | ||
| ７． | AA-KClストック溶液（×50） | 100ml |
| KCl 15g | ||
| ８． | AA-6 Vitaminストック溶液(×1000) | 10ml |
| Nicotinic acid 10mg；Pyridoxine-HCl 10mg；Thiamine-HCl 0.1g；myo-Inositol 1g | ||
- AA-6 Vitaminは－20℃保存．それ以外は４℃保存。
AAM培地（アグロバクテリウム感染用）
| 最終濃度 | 試薬名・ストック溶液名 | 1l |
|---|---|---|
| ① 0.3g/l | L-Aspartic acida | 0.3g |
| ② | AA-1(×1000） | 1ml |
| ③ | AA-2(×1000） | 1ml |
| ④ | AA-3(×1000） | 1ml |
| ⑤ | Fe-EDTA(×1000） | 1ml |
| ⑥ | AA-5(×1000） | 1ml |
| ⑦ | AA-6 Vitamin(×1000） | 1ml |
| ⑧ | AA-Sol(×100） | 10ml |
| ⑨ | AA-KCl(×50） | 20ml |
| ⑩ 0.5g/l | Casamino acids | 0.5g |
| ⑪6.85％ | Sucrose | 68.5g |
| ⑫0.9g/l | L-Glutamine | 0.9g |
| ↓2N KOHでpH5.2に調整し， 0.9Lにメスアップ。 | ||
| ↓オートクレーブ | ||
| 室温に冷ましたのちグルコース溶液を添加。 | ||
| ⑬3.6％ | 36％(w/v)D-(＋)-Glucose（オートクレーブ滅菌） | 100ml |
| 100ml三角フラスコに90mlずつ分注し，４℃保存。 | ||
- a L-Aspartic acidは溶解しにくいので最初に加える。
