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==アグロバクテリウム法によるイネの形質転換==

; Agrobacteriun-mediated transformation of rice

イネはアグロバクテリウムの宿主でないため，イネへの遺伝子導入はエレクトロポレーションやパーティクルガン等の直接導入法が主流であった。近年アグロバクテリウムを介した間接導入法が適用され，未経験者でも容易にイネに遺伝子を導入できるようになった。

* 著者：増本千都 (Chisato Masumoto) , 宮尾光恵 (Mitsue Miyao) 農業生物資源研究所・光環境応答研究ユニット
* 誌名：低温科学 (Low Temperature Science) vol.67, 641-647 (2009)
* 出版者：北海道大学低温科学研究所 (Institute of Low Temperature Science, Hokkaido University) 
* 引用：「光合成研究法」北海道大学低温科学研究所, 日本光合成研究会共編
* Doc URL：http://hdl.handle.net/2115/39205

==原理と概要==

従来イネへの遺伝子導入は，プロトプラストを用いたエレクトロポレーション法やPEG (ポリエチレングリコール) 法，カルスを用いたパーティクルガン法等，直接導入法が中心であった。1994年にアグロバクテリウム (Rhizobium radiobacter；旧称Agrobacterium tumefaciens) を介したイネへの遺伝子導入法が開発された<ref name="hiei">Y.Hiei, S.Ohta, T.Komari, &T.Kumashiro, Plant J.; 6 (1994) P.271</ref>。本法では特殊な装置が不要で操作も簡単であり，かつ高効率で完全長の遺伝子をゲノムに導入できる。遺伝子導入法と培地組成<ref>H.Rashid, S.Yokoi, K.Toriyama, &K.Hinata, Plant Cell Rep.; 15 (1996) P.727</ref><ref name="toki">S.Toki, Plant Mol.Biol.Rep.; 15 (1997) P.16</ref><ref name="komamine">駒嶺穆，野村港二，「生物化学実験法41植物細胞工学入門」学会出版センター; (1998) P.311</ref><ref>島本功，岡田清孝，「新版モデル植物の実験プロトコール-遺伝的手法からゲノム解析まで」秀潤社; (2001) P.93</ref>，また遺伝子導入用バイナリーベクターと選抜薬剤耐性マーカー遺伝子にも改良が重ねられ，現在では未経験者でも簡単に形質転換イネが作製できるようになった。

単子葉植物であるイネはアグロバクテリウムの宿主範囲外である。アグロバクテリウムの宿主となる双子葉植物では，アグロバクテリウムが感染するとTiプラスミドのVir領域を活性化するフェノール化合物 (アセトシリンゴン，シナピン酸等) が合成され，TiプラスミドからT-DNAが切り出され，いくつかの過程を経て宿主の核染色体DNAに組み込まれる。イネはこれらのフェノール化合物を合成しないためアグロバクテリウム法が適用できなかったが，アグロバクテリウム感染時にアセトシリンゴンを添加することによって，アグロバクテリウムを介した遺伝子導入が可能になった<ref name="hiei"/>。現在用いられている一般的な方法は，再分化能が高い種子胚盤由来のカルスにアグロバクテリウムを感染させる方法 (カルス法：日本たばこ特許) で，遺伝子が導入されたカルスを薬剤 (抗生物質) 耐性で選抜したのち，植物体を再分化させる。感染から約 3 ヶ月で形質転換イネが得られる。種子に直接アグロバクテリウムを感染させカルス培養期間を短縮する方法 (種子法) も報告されている<ref>S.Toki, N.Hara, K.Ono, H.Onodera, A.Tagiri, S.Oka, &H.Tanaka, Plant J.; 47 (2006) P.969</ref>。

イネへの遺伝子導入効率が高いことから，アグロバクテリウムの系統EHA101とEHA105がもっともよく使われている。EHA105は，カナマイシン耐性 (Km<sup>r</sup>) のEHA101からカナマイシン耐性遺伝子を除いた系統で，バイナリーベクター (Km<sup>r</sup>) が導入されたアグロバクテリウムをカナマイシン耐性で確実に選抜することができる。選抜用薬剤としては，ハイグロマイシン (hygromycin，Hm；原核型タンパク質合成阻害剤) が汎用されている。しかし，ハイグロマイシンの場合は耐性カルスの選抜が難しいことから，ビアラフォス (biala-phos；グルタミン合成酵素阻害剤) ，ALS (アセト乳酸脱水素酵素) 阻害剤等，除草剤を選抜薬剤として用いる方法が複数開発されている。バイナリーベクターは，pBI101由来のベクターに薬剤耐性遺伝子 (ハイグロマイシン耐性遺伝子，hpt；ビアラフォス耐性遺伝子，bar等) を導入したもの (例えば，pBI101Hm，pIG121Hm，pGPTVbar) が汎用されている。また，市販のpCAMBIAシリーズも使用できる (pBI101系ベクターに比べて大腸菌内での増幅コピー数が多い) 。

==試薬の調整==

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==培地の調整==

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==イネへの遺伝子導入法==

アグロバクテリウムEHA株, pBI系あるいはpCAM-BIA系バイナリーベクター，選抜薬剤としてハイグロマイシンとビアラフォスを用いたカルス法<ref name="toki"/><ref name="komamine"/>。を若干改変) を紹介する。種子法に比べて時間がかかるものの，少ない種子から多数の形質転換イネが得られる。一般的な日本型イネ品種 (日本晴，キタアケ，農林６号，農林８号：日本晴型) に用いられる培地組成と作製法を表 1-3 に示す。日本晴はカルス培養が容易な品種であり， 50 ％以上の種子から増殖能の高いカルスが得られ，遺伝子導入効率 (最終的に得られる形質転換イネの個体数) はアグロバクテリウムを感染させたカルス数の 50 ％に達する。キタアケの場合は，日本晴に比べるとカルスの増殖が若干悪く，遺伝子導入効率は 10-20 ％である。

コシヒカリ，あきたこまち，ひとめぼれはカルス培養が困難な品種として知られている。これはカルスの亜硝酸還元酵素活性が低いことが原因で，一般的な培養条件では亜硝酸が蓄積し，カルスが褐変，壊死するためである<ref name="ogawa">小川泰一，化学と生物; 38 (2000) P.189</ref>。これらの品種でも培地組成を改良することで遺伝子導入が可能になっている<ref name="ogawa"/>。

アグロバクテリウムは 28 ℃，暗所で培養する。カルスと植物体は 28-33 ℃，明所 (30 μmol photons m<sup>-2</sup>s<sup>-1</sup>) で培養する。シャーレはガンマ線滅菌されたプラスチックシャーレ (直径 9 cm ，深さ 20 mm (アグロバクテリウム用のみ深さ 15 mm ))を用い，培地を入れたプレートはサージカルテープでシールする。 2-3 日間室温で保存し，カビ等が生えていないこと確認してから 4 ℃で保存。3 ヶ月以上は保存しない。選抜に用いるハイグロマイシン，ビアラフォス濃度はそれぞれ 50， 5 mg/l である (日本晴，キタアケの場合) 。

;参考文献
<references/>

===種子の選別，種子滅菌とカルス誘導 (3週間)===

: 玄米を2,4-Dを含むカルス誘導用プレート (N6D培地) で培養し，胚盤からカルスを誘導・増殖させる。

; ［準備］
: 種子 (籾) 約 150 粒；小型籾すり器 (藤原製作所) ；プラスチックシャーレ； 70 ％エタノール；次亜塩素酸ナトリウム溶液 (食品添加物用，有効塩素濃度約5％) ；Tween20； 50 ml ファルコンチューブ；滅菌水約 1 l ；レシプロ型振盪機；オートクレーブ滅菌した濾紙 (直径 7 cm ，数～ 10 枚) ；オートクレーブ滅菌したピンセット；N6Dプレート 10 枚；サージカルテープ

; ［実験方法］
# よく充実した種子 (籾) を選ぶ。黒ずんだり傷のある籾は使わない。小型籾摺り器で籾殻を取り除く。白色半透明の玄米 100-150 粒を選抜する。緑色あるいは黒ずんだ玄米はカビ等の混入の原因となるので除く。
# 滅菌溶液を作製する。 50 ml ファルコンチューブに次亜塩素酸ナトリウム溶液 20 ml ，滅菌水 20 ml ，Tween20を1滴入れる。チューブ2本を用時調製。
# 選抜した玄米 100-150 粒をシャーレに入れる。玄米が浸かる程度に 70 ％エタノールを加え， 30 秒間手で軽く振盪したのち， 70 ％エタノールを素早く捨てる。この操作で滅菌溶液を浸透しやすくする。
# 玄米を滅菌溶液に移し，150-200 rpm で 15 分間振盪する。
# デカントで滅菌溶液を交換し，15 分間振盪する。以下はクリーンベンチ内で作業する。
# チューブをデカントして滅菌溶液を捨て，新たに滅菌水 40 ml を入れ玄米をすすぐ。この操作を 5-6 回繰り返し，最後に洗浄水を捨てる。
# プラスチックシャーレに滅菌濾紙を数枚入れ，その上に滅菌した玄米を広げ水を切る。
# ピンセットで玄米をN6Dプレートに置床する (プレート1枚あたり 10 粒；プレート 10 枚) 。この時，胚だけ培地から出るようにする。シャーレをサージカルテープでシールする。
# 30-33 ℃ で 21 日間培養する (暗所，明所どちらでも構わない) 。

* 培養開始後数日間は，カビや雑菌が発生していないか毎日チェックする (雑菌等が生えると種子のまわりが白濁する。プレートを光にかざすとわかりやすい) 。雑菌等が生えた種子は取り除く。種子を除いても雑菌は残されたままなので，雑菌発生場所近傍の種子から増殖したカルスは使用しない。
* 誘導されたカルスを培地に直接置き直すと，増殖が促進される。
* カルスの増殖が悪い場合 (多くは褐色を呈する) は，培地のカザミノ酸 (窒素源) 濃度を上げると改善されることが多い。

===カルスの前培養 (感染 3 日前に開始) ===

: 増殖能の高いカルス選抜し，新しいN6Dプレートに移植する。アグロバクテリウムを感染させるカルスの増殖能が遺伝子導入効率に大きく影響する。胚盤上で増殖したカルスの塊より，塊からこぼれ落ちたカルスの方が増殖能が高い。褐色がかったカルスは増殖能が低いので使用しない。カルスの増殖に問題がなければ，玄米 1 個から感染に使用できるカルスが 5-20 個取れる。

; ［準備］
: N6Dプレート 2 枚；ピンセット (滅菌済み) ；サージカルテープ

; ［実験方法］
# 直径約 2-3 mm の淡黄色で固いカルスを選び，ピンセットで新しいN6Dプレートに置床する (プレート 1 枚あたり 200 個，プレート 2 枚) 。この時カルスをプレートに軽く押しつけるようにする。
# 30-33 ℃，3 日間培養する (暗所，明所どちらでも構わない) 。

===アグロバクテリウムの前培養 (感染 3 日前に開始) ===

: バイナリーベクターを導入したアグロバクテリウムを増殖させる。ハイグロマイシン選抜の場合，カナマイシンとハイグロマイシンを含む培地 (AB培地) で培養する。ビアラフォス選抜の場合，カナマイシンのみを含む培地を使用する。

; ［準備］
: ABプレート (カルス 400 個あたり 1 枚) ；白金耳または滅菌済みミクロスパーテル；サージカルテープ

; ［実験方法］
# アグロバクテリウムのグリセロールストックの表面を白金耳またはミクロスパーテルで掻き取る。
# ABプレートにアグロバクテリウムを塗布し，サージカルテープでシールする。
# 28 ℃，暗所で 3 日間培養する。30 ℃を越えるとアグロバクテリウムからプラスミドが脱落しやすくなるので培養温度に注意する。

===アグロバクテリウムの接種と共存培養 (3 日)===

: カルスにアグロバクテリウムを接種したのち，3 日間共存培養して感染させる。接種時のアグロバクテリウム濃度が低い方が感染効率が高い。アグロバクテリウム懸濁液がかすかに濁るか濁らない程度で充分である。

; ［準備］
: 50 ml ファルコンチューブ；AAM培地；アセトシリンゴン溶液；2N6ASプレート 1 枚；滅菌した濾紙 (直径 7 cm) ；ミクロスパーテル (滅菌済み) ；駒込ピペット (10 ml ，滅菌済み) ；ステンレス製茶こし (滅菌済み) ；ピンセット (滅菌済み) ；プラスチックシャーレ

[[Image:Horticulture-Oryza-sativa-001.png|200px|thumb|AB培地で3日間培養したアグロバクテリウム。
コロニーが判別できる程度に増殖したところ (丸で囲んだ部分) の菌体をミクロスパーテルで掻き取り，アグロバクテリウム感染用のAAM培地 40 ml に懸濁する。
]]
; ［実験方法］
# 50 ml ファルコンチューブにAAM培地 40 ml を入れ，アセトシリンゴン溶液 (100 mg/ml) を 4 μl 加える (終濃度10mg/l) 。
# 2N6ASプレート上に滅菌した濾紙をのせ，その上にステップ 1 のアセトシリンゴン入りAAM培地を 1 ml 注ぐ。
# 茶こしを空のプラスチックシャーレに置く。シャーレの蓋に滅菌濾紙を 2-3 枚敷く。
# 前培養したアグロバクテリウムをミクロスパーテルで掻き取り (ミクロスパーテルの 1/5 程度，約 5 μl ；図) ，ステップ 1 のAAM培地 (約 40 ml) に懸濁する。懸濁液を駒込めピペットで 100 回程度ピペッティングしてアグロバクテリウムを分散させる。
# プラスチックシャーレに置いた茶こし (ステップ 3) に前培養したカルスを約 200 個入れる (100-200 個) 。この時，直径約 2 mm の淡黄色の固いカルスを選ぶ。
# カルスにアグロバクテリウム懸濁液 (約 40 ml) をかけ，茶こしを時々揺すりながら 90-120 秒間アグロバクテリウムを接種する。
# シャーレの蓋に敷いたろ紙 (ステップ 3) の上に茶こしを置き，アグロバクテリウム懸濁液を切る。
# 2N6ASプレート上に敷いた濾紙 (ステップ 2) にカルスを置床し (プレート 1 枚あたり約 200 個) ，サージカルテープでシールする。
# 28 ℃，暗所で 3 日間培養する。 3 日間培養するとアグロバクテリウムがカルスを覆うように増殖する。

===アグロバクテリウムの除去 (除菌) とカルスの薬剤選抜 (2 週間 x1 または x2)===

:  アグロバクテリウムと共存培養したカルスをカルベニシリン (carbenicillin: グラム陰性桿菌用抗生物質，アグロバクテリウム除菌用) 溶液 (500 mg/l) で洗浄したのち，カルベニシリン (300 mg/l) と選抜薬剤を含むN6D培地で培養し，薬剤耐性カルスを選抜する。 2 週間の薬剤選抜を2回繰り返すのが一般的であるが，ハイグロマイシン選抜の場合は耐性カルスと感受性カルスの区別がつきにくいため， 2 週間選抜培地で培養したのち，再分化を開始する。選抜培地での培養は除菌効果が高いため，最低1回は行う。ビアラフォス選抜の場合は, 2 回 (2 週間× 2) または3回 (2週間× 2, 7-10 日間× 1) の培養で耐性カルスが選抜できる (感受性カルスは増殖せず，褐変する) 。

; ［準備］
: 50 ml ファルコンチューブ；滅菌水；カルベニシリンストック溶液；選抜用N6Dプレート (選抜1回あたり 8  枚) ；ピンセット (滅菌済み) ；サージカルテープ

; ［実験方法］
# 滅菌水 40 ml を入れた 50 ml ファルコンチューブに共存培養したカルス約 200 個 (100-200 個) を入れる。蓋をしてチューブを数回反転させ，カルスを洗浄する。この操作を 5 回繰り返す。
# 同様に，500 mg/l カルベニシリン溶液 (滅菌水 40 ml にカルベニシリンストック溶液を 100 μl 添加) でカルスを 3 回洗浄する。ここまでの操作でカルスは直径約 3 mm に膨潤する。
# 選抜用N6Dプレートに直径約 3 mm のカルスを置床する (プレート 1 枚あたり 25 個) 。カルスの破片は置床しない。
# 30-33 ℃， 14 日間培養する (暗所，明所どちらでも構わない) 。

* 除菌が不充分でアグロバクテリウムが増殖する場合，カルスを滅菌水で5回，引き続きカルベニシリン溶液で5回洗浄し直すと除菌できる。ただし，この処理はアグロバクテリウムがコロニーを形成して1日以内でないと効果はない。

# ビアラフォス選抜の場合は，選抜用N6Dプレート上で増殖したカルスの一部を次の選抜培地 (カザミノ酸濃度を 200 mg/l に下げた選抜用N6Dプレート) に移植し (プレート 1 枚あたり 16 個) ，選抜を繰り返す。

===植物体の再分化 (1-2 週間) ===

: オーキシン (ナフタレン酢酸; NAA)，サイトカイニン (カイネチン)，選抜薬剤を含む再分化培地 (MS培地＋ビタミン類，ショ糖，ソルビトール，カザミノ酸) でカルスを培養し，植物体を再分化させる。再分化培地にはカルベニシリン (200 mg/l) も含まれるが，アグロバクテリウムの増殖が認められる場合，カルスを新しいプレートに移植し直す。

; ［準備］
: 再分化用プレート；ピンセット (滅菌済み) 

; ［実験方法］
# 再分化用プレートにカルスを移植する。プレートを 4 区画に分け， 1 区画に同一カルス由来のカルス 5-7 個を置床する。

* 薬剤選抜中に増殖するカルスは小さい塊を形成する。これらの小さいカルス，あるいは薬剤選抜用プレートに置床したカルスから形成した大きい塊の淡黄色の部分を置床する。

# 28-30 ℃，明所で 7-14 日間培養する (最長 1 ヶ月) 。早いものでは培養 3 日目からカルスにグリーンのスポットが現れ，そこから植物体が再分化する。グリーンスポットをもつカルスが増えたら， 1 区画あたり  5 個程度残し，残りは除去する。
# シュートが 1-2 cm に伸長したら，発根用ホルモンフリー培地に移植する。再分化プレート上で根が伸長する場合もある。その場合，シュートと根を切らないように移植する。
# 再分化しなかった場合，カルスを 100 mg/l カルベニシリンを含む再分化プレートに移植し (プレート 1 枚あたり 5-10 個) ， 28-30 ℃，明所で 7-14 日間培養する。

===ホルモンフリー培地による根の伸長促進と土壌への移植 (2-3 週間) ===

: シュートが 1-2 cm に伸びた再分化植物をホルモンを含まない培地 (ホルモンフリー培地；MS培地＋ビタミン類，ショ糖) に移植し，根を伸長させる。再分化植物が充分に大きくなったら，空気 (低湿度) に順化させたのち，土壌に移植する (鉢上げ) 。ホルモンフリー培地で 1 ヶ月培養した個体も鉢上げする。

; ［準備］
: 発根用ホルモンフリープレート；ピンセット (滅菌済み) 

; ［実験方法］
# シュートが 1-2 cm に伸びた再分化植物をホルモンフリープレートに移植する。通常単一のカルスから複数の植物体が再分化するので，まず再分化プレート上で植物を株分けする (シュートと根をもつ苗に分ける) 。この時周囲のカルスをできるだけ除く。ホルモンフリープレートに小さな穴をあけ，株分けした苗を埋め込むように移植する。培養にともなってアルビノになるケースもあるので，同一カルス由来の苗をプレート 1 枚に 2-3 個体移植する。
# 28-30 ℃，明所で 2-3 週間培養する (最長 4 週間) 。生育が悪い場合，新しいプレートに植え替える。
# シャーレ一杯に植物体が成長したら (草丈 7～10 cm ，根はプレートの底に展開する) ，シャーレの蓋をはずし水を張って，明所 (10 μmol photons m<sup>-2</sup>s<sup>-1</sup> 以下；室内照明用蛍光灯程度の明るさ) に置き，植物体を 3 日間空気に順化させる。
# 流水あるいは水を張ったバットの中で培地を洗い落としながら再分化植物を株分けし，土壌に移植する。この時，シュート 1 個を 1 個体とする。移植後 5 日間程度は寒冷紗をかけ強光が当たらないようにする。

* 順化処理を行っても鉢上げ後枯死する場合があるので，同一カルス由来の再分化植物を 2-3 個体移植し，新しい葉が展開したら間引きする。
* 同一カルス由来であっても，株分けをせずに複数のシュートをまとめて移植するとキメラになる場合があるので，必ず株分けする。