PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum
From Metabolomics.JP
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* サージカルテープでシール(選抜 1)。 | * サージカルテープでシール(選抜 1)。 | ||
* パラフィルムでシール(選抜 2)。 | * パラフィルムでシール(選抜 2)。 | ||
− | * | + | * 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。 |
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* パラフィルムでシール。 | * パラフィルムでシール。 | ||
− | * 1シャーレあたり | + | * 1シャーレあたり 20切片以下。 |
* 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。 | * 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。 | ||
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; 選抜4回目(シュート伸長・発根) | ; 選抜4回目(シュート伸長・発根) | ||
− | : シュート伸長・発根誘導培地:MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar | + | : シュート伸長・発根誘導培地:MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar |
: カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す | : カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す | ||
: | : | ||
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: 発根誘導培地:MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar | : 発根誘導培地:MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar | ||
; point | ; point | ||
− | * | + | * シュートの条件:発根したカルスから取る。大きさ( 2cm程度。 |
* 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。 | * 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。 | ||
− | * | + | * アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。 |
* 花芽は切り落とす!! | * 花芽は切り落とす!! | ||
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; (平均インサート長:80 Kb) | ; (平均インサート長:80 Kb) | ||
: 1ベクターあたり | : 1ベクターあたり | ||
− | : | + | : 感染:240 切片 |
: 馴化できた系統数: 0-21 系統作出 | : 馴化できた系統数: 0-21 系統作出 | ||
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Latest revision as of 16:04, 1 September 2011
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[edit] トマト遺伝子導入実験プロトコール
2005. 6/27 改正版 |
[edit] 形質転換スケジュール
[edit] 実験プロトコール
[edit] 滅菌
[edit] 洗浄
クリーンベンチ作業
- point
- 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。
[edit] 播種
クリーンベンチ作業
[edit] 前培養
クリーンベンチ作業
→湿らしたろ紙へ一時置き→ |
- point
- 本葉が出たものはNG。
- 作業中乾かないように注意!!
- 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。
[edit] アグロバクテリウムの調整
- 前培養;
- LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
- ↓2 日間 28 ℃,暗所
- 感染用培養;
- シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
- ↓2 日間 28 ℃,暗所
- point
- 必ず増殖中(盛り上がる前)の菌プレートを用意する。
- 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。
[edit] 感染
- 注)改善の余地あり
[edit] 除菌
- 注)改善の余地あり
- 洗浄:MS液体培地
- 除菌:MS液体培地+Cb 500 mg/l
- point
- 傷をつけないように気をつける。
[edit] 選抜
[edit] 馴化
→ |
- point
- 根を傷つけない
- ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
- 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
- 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。
[edit] 効率
- 植物形質転換用バイナリーベクター
- Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
|
- point
- カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
- Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
- Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens