PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum

From Metabolomics.JP
(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
 
(48 intermediate revisions by 2 users not shown)
Line 1: Line 1:
 +
{{PlantBiotech/Header}}
 +
{| style="float:right"
 +
|__TOC__
 +
|}
 +
 
==トマト遺伝子導入実験プロトコール==
 
==トマト遺伝子導入実験プロトコール==
  
 
{|
 
{|
 
|
 
|
||[[Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_011.jpg|200px]]
+
||[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-001.png|250px]]
 
|
 
|
2005.6/27改正版
+
2005. 6/27 改正版
 
|}
 
|}
 
  
 
==形質転換スケジュール==
 
==形質転換スケジュール==
 
{|
 
{|
||[[Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_021.jpg|200px]]
+
||[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-002.png|300px]]
|
+
; 月曜日
+
: シングルコロニーの培養
+
: 除菌・選抜(1回目)
+
: ↓
+
; 水曜日
+
: トマト播種
+
: トマト前培養
+
: 感染用アグロの培養
+
: ↓
+
; 金曜日
+
: 感染
+
: ↓
+
; 以降2週間おきに選抜
+
 
|}
 
|}
 
  
 
==実験プロトコール==
 
==実験プロトコール==
Line 34: Line 23:
 
<center>
 
<center>
 
<gallery perrow="4">
 
<gallery perrow="4">
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_031.jpg|700mg/300粒
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-003.png|700 mg/300 粒
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_032.jpg|70%EtOH 2分振とう
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-004.png|70 % EtOH 2 分振とう
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_033.jpg|
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-005.png|
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_034.jpg|1%次亜塩+200μl/L tween 10分振とう
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-006.png|1 % 次亜塩+ 200 μl/L tween 10 分振とう
 
</gallery>
 
</gallery>
 
</center>
 
</center>
 
  
 
===洗浄===
 
===洗浄===
Line 46: Line 34:
 
<center>
 
<center>
 
<gallery perrow="3">
 
<gallery perrow="3">
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_041.jpg|洗浄前
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-007.png|洗浄前
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_042.jpg|SDWで1分間×5回洗浄
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-008.png|SDWで 1 分間× 5 回洗浄
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_043.jpg|洗浄後
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-009.png|洗浄後
 
</gallery>
 
</gallery>
 
</center>
 
</center>
 
;point
 
;point
 
* 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。
 
* 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。
 
  
 
===播種===
 
===播種===
Line 59: Line 46:
 
<center>
 
<center>
 
<gallery perrow="3">
 
<gallery perrow="3">
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_051.jpg|1/2MS+3%Suc+0.8%Agar pH5.8 25℃,16h日長で培養]
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-010.png|1/2 MS+3 % Suc+ 0.8 % Agar pH 5.8 25 ℃, 16 h 日長で培養
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_052.jpg|50-60粒/7cm<br>マヨネーズ瓶
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-011.png|50-60 粒/7 cm <br>マヨネーズ瓶
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_053.jpg|50粒播種するとこんな感じ<br>→約1週間培養
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-012.png|50 粒播種するとこんな感じ<br>→約 1 週間培養
 
</gallery>
 
</gallery>
 
</center>
 
</center>
 
  
 
===前培養===
 
===前培養===
Line 70: Line 56:
 
<center>
 
<center>
 
{|  
 
{|  
|[[Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_061.jpg|200px|thumb|作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように<br>胚軸は下の方を使う<br>子葉の両端を切る]]
+
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-013.png|150px|thumb|作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように<br>胚軸は下の方を使う<br>子葉の両端を切る]]
 
|→湿らしたろ紙へ一時置き→
 
|→湿らしたろ紙へ一時置き→
|[[Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_062.jpg|200px|thumb|MS+2mg/l Zeatin+3%Suc+0.8%Agar<br>48切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ)<br>パラフィルムでシール<br>→2日間,25℃,16h日長で培養]]
+
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|200px|thumb|MS+ 2 mg/l Zeatin+ 3 % Suc+0.8 % Agar<br>48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ)<br>パラフィルムでシール<br>→ 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養]]
 
|}
 
|}
 
</center>
 
</center>
 
;point
 
;point
 
* 本葉が出たものはNG。
 
* 本葉が出たものはNG。
* 作業中乾かないように注意!
+
* 作業中乾かないように注意!!
 
* 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。
 
* 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。
 
  
 
===アグロバクテリウムの調整===
 
===アグロバクテリウムの調整===
 
; 前培養;
 
; 前培養;
 
: LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
 
: LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
: ↓2日間 28℃,暗所
+
: ↓2 日間 28 ℃,暗所
 
: 
 
: 
 
; 感染用培養;
 
; 感染用培養;
 
: シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
 
: シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
: ↓2日間 28℃,暗所
+
: ↓2 日間 28 ℃,暗所
 
: 
 
: 
 
;point
 
;point
 
* 必ず増殖中(盛り上がる前)の菌プレートを用意する。
 
* 必ず増殖中(盛り上がる前)の菌プレートを用意する。
 
* 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。
 
* 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。
 
  
 
===感染===
 
===感染===
Line 99: Line 83:
 
<center>
 
<center>
 
<gallery perrow="5">
 
<gallery perrow="5">
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_081.jpg|菌液の準備;<br>MS液体培地50ml+アセトシリンゴン(10mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-015.png|菌液の準備;<br>MS液体培地 50 ml +アセトシリンゴン(10 mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_082.jpg|切片を滅菌した茶漉しに入れ<br>菌液内で1分間攪拌
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|切片を滅菌した茶漉しに入れ<br>菌液内で 1 分間攪拌
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_083.jpg|滅菌したキムタオルで<br>水分除去
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|滅菌したキムタオルで<br>水分除去
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_084.jpg|さらに水分除去
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-018.png|さらに水分除去
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_085.jpg|元の培地に<br>(3日間,21℃,遮光)
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|元の培地に<br>(3 日間, 21 ℃,遮光)
 
</gallery>
 
</gallery>
 
</center>
 
</center>
 
  
 
===除菌===
 
===除菌===
 
;注)改善の余地あり
 
;注)改善の余地あり
 
: 洗浄:MS液体培地
 
: 洗浄:MS液体培地
: 除菌:MS液体培地+Cb500mg/l
+
: 除菌:MS液体培地+Cb 500 mg/l
 
<center>
 
<center>
 
<gallery perrow="2">
 
<gallery perrow="2">
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_091.jpg|2,3分ゆすりながら洗う<br>洗浄1回/除菌1回
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|2,3 分ゆすりながら洗う<br>洗浄 1 回/除菌 1 回
Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_092.jpg|水分除去→選抜へ<br>(2週間,25℃,16h日)
+
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|水分除去→選抜へ<br>(2 週間, 25 ℃, 16 h 日長)
 
</gallery>
 
</gallery>
 
</center>
 
</center>
 
;point
 
;point
 
* 傷をつけないように気をつける。
 
* 傷をつけないように気をつける。
 
  
 
===選抜===
 
===選抜===
 
{|
 
{|
| [[Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_91.jpg|200px]]
+
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|150px]]
|  
+
|
;選抜1,2回目(カルス誘導)
+
; 選抜1,2回目(カルス誘導)
: カルス誘導培地:MS+2mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8%Agar
+
: カルス誘導培地:MS+ 2 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+0.8 % Agar
;point
+
; point
 
* サージカルテープでシール(選抜 1)。
 
* サージカルテープでシール(選抜 1)。
 
* パラフィルムでシール(選抜 2)。
 
* パラフィルムでシール(選抜 2)。
 
* 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
 
* 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
:
 
 
|-
 
|-
|[[Image:Tochimoto-Peony-芍薬 P11 グラフ2.jpg|300px]]
 
 
|
 
|
:↓
+
|
;選抜3回目(再分化誘導)
+
; 選抜3回目(再分化誘導)
: 再分化誘導培地 MS+1mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8% Agar
+
: 再分化誘導培地 MS+ 1 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar
;point
+
; point
 
* パラフィルムでシール。
 
* パラフィルムでシール。
 
* 1シャーレあたり 20切片以下。
 
* 1シャーレあたり 20切片以下。
 
* 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
 
* 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
 +
|-
 +
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-019.png|150px]]
 +
| 
 +
; 選抜4回目(シュート伸長・発根)
 +
: シュート伸長・発根誘導培地:MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
 +
: カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
 +
: 
 +
|-
 +
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png|150px]]
 +
| 
 +
; 選抜5回目(発根)
 +
: 発根誘導培地:MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
 +
; point
 +
* シュートの条件:発根したカルスから取る。大きさ( 2cm程度。
 +
* 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。
 +
* アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。
 +
* 花芽は切り落とす!!
 +
|}
 +
 +
===馴化===
 +
<center>
 +
{|
 +
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png|150px|thumb|]]
 +
| →
 +
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-021.png|150px|thumb|]]
 +
|}
 +
</center>
 +
; point
 +
* 根を傷つけない
 +
* ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
 +
* 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
 +
* 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。
 +
 +
===効率===
 +
; 植物形質転換用バイナリーベクター
 +
: Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
 +
{|
 +
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-022.png|200px]]
 +
|
 +
; (平均インサート長:80 Kb)
 +
: 1ベクターあたり
 +
:  感染:240 切片
 +
:  馴化できた系統数: 0-21 系統作出
 
|}
 
|}
 +
; point
 +
* カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
 +
: Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
 +
: Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens

Latest revision as of 16:04, 1 September 2011

トップページ イネ ミヤコグサ トマト ダイズ 培地一覧

Contents

[edit] トマト遺伝子導入実験プロトコール

Horticulture-Solanum-lycopersicum-001.png

2005. 6/27 改正版

[edit] 形質転換スケジュール

Horticulture-Solanum-lycopersicum-002.png

[edit] 実験プロトコール

[edit] 滅菌

[edit] 洗浄

クリーンベンチ作業

point
  • 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。

[edit] 播種

クリーンベンチ作業

[edit] 前培養

クリーンベンチ作業

作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように
胚軸は下の方を使う
子葉の両端を切る
→湿らしたろ紙へ一時置き→
MS+ 2 mg/l Zeatin+ 3 % Suc+0.8 % Agar
48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ)
パラフィルムでシール
→ 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養
point
  • 本葉が出たものはNG。
  • 作業中乾かないように注意!!
  • 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。

[edit] アグロバクテリウムの調整

 前培養;
 LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
 ↓2 日間 28 ℃,暗所
 
 感染用培養;
 シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
 ↓2 日間 28 ℃,暗所
 
point
  • 必ず増殖中(盛り上がる前)の菌プレートを用意する。
  • 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。

[edit] 感染

注)改善の余地あり

[edit] 除菌

注)改善の余地あり
 洗浄:MS液体培地
 除菌:MS液体培地+Cb 500 mg/l
point
  • 傷をつけないように気をつける。

[edit] 選抜

Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png
選抜1,2回目(カルス誘導)
カルス誘導培地:MS+ 2 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+0.8 % Agar
point
  • サージカルテープでシール(選抜 1)。
  • パラフィルムでシール(選抜 2)。
  • 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
選抜3回目(再分化誘導)
再分化誘導培地 MS+ 1 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar
point
  • パラフィルムでシール。
  • 1シャーレあたり 20切片以下。
  • 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
Horticulture-Solanum-lycopersicum-019.png  
選抜4回目(シュート伸長・発根)
シュート伸長・発根誘導培地:MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
 
Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png  
選抜5回目(発根)
発根誘導培地:MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
point
  • シュートの条件:発根したカルスから取る。大きさ( 2cm程度。
  • 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。
  • アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。
  • 花芽は切り落とす!!

[edit] 馴化

Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png
Horticulture-Solanum-lycopersicum-021.png
point
  • 根を傷つけない
  • ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
  • 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
  • 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。

[edit] 効率

植物形質転換用バイナリーベクター
Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
Horticulture-Solanum-lycopersicum-022.png
(平均インサート長:80 Kb)
1ベクターあたり
 感染:240 切片
 馴化できた系統数: 0-21 系統作出
point
  • カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens
Personal tools

Variants
Actions
Navigation
metabolites
Toolbox