PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum

From Metabolomics.JP
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-004.png|70 % EtOH 2 分振とう
 
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-004.png|70 % EtOH 2 分振とう
 
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-007.png|洗浄前
 
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-007.png|洗浄前
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-008.png|SDWで1分間×5回洗浄
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-008.png|SDWで 1 分間× 5 回洗浄
 
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-009.png|洗浄後
 
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-009.png|洗浄後
 
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-010.png|1/2MS+3%Suc+0.8%Agar pH5.8 25℃,16h日長で培養]
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-010.png|1/2 MS+3 % Suc+ 0.8 % Agar pH 5.8 25 ℃, 16 h 日長で培養]
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-011.png|50-60粒/7cm<br>マヨネーズ瓶
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-011.png|50-60 粒/7 cm <br>マヨネーズ瓶
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-012.png|50粒播種するとこんな感じ<br>→約1週間培養
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-012.png|50 粒播種するとこんな感じ<br>→約 1 週間培養
 
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|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-013.png|150px|thumb|作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように<br>胚軸は下の方を使う<br>子葉の両端を切る]]
 
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-013.png|150px|thumb|作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように<br>胚軸は下の方を使う<br>子葉の両端を切る]]
 
|→湿らしたろ紙へ一時置き→
 
|→湿らしたろ紙へ一時置き→
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|150px|thumb|MS+2mg/l Zeatin+3%Suc+0.8%Agar<br>48切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ)<br>パラフィルムでシール<br>→2日間,25℃,16h日長で培養]]
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|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|150px|thumb|MS+ 2 mg/l Zeatin+ 3 % Suc+0.8 % Agar<br>48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ)<br>パラフィルムでシール<br>→ 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養]]
 
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; 前培養;
 
; 前培養;
 
: LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
 
: LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
: ↓2日間 28℃,暗所
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: ↓2 日間 28 ℃,暗所
 
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; 感染用培養;
 
; 感染用培養;
 
: シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
 
: シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
: ↓2日間 28℃,暗所
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: ↓2 日間 28 ℃,暗所
 
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-015.png|菌液の準備;<br>MS液体培地50ml+アセトシリンゴン(10mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-015.png|菌液の準備;<br>MS液体培地 50 ml +アセトシリンゴン(10 mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|切片を滅菌した茶漉しに入れ<br>菌液内で1分間攪拌
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|切片を滅菌した茶漉しに入れ<br>菌液内で 1 分間攪拌
 
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|滅菌したキムタオルで<br>水分除去
 
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|滅菌したキムタオルで<br>水分除去
 
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-018.png|さらに水分除去
 
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-018.png|さらに水分除去
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|元の培地に<br>(3日間,21℃,遮光)
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|元の培地に<br>(3 日間, 21 ℃,遮光)
 
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;注)改善の余地あり
 
;注)改善の余地あり
 
: 洗浄:MS液体培地
 
: 洗浄:MS液体培地
: 除菌:MS液体培地+Cb500mg/l
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: 除菌:MS液体培地+Cb 500 mg/l
 
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|2,3分ゆすりながら洗う<br>洗浄1回/除菌1回
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|2,3 分ゆすりながら洗う<br>洗浄 1 回/除菌 1 回
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|水分除去→選抜へ<br>(2週間,25℃,16h日)
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|水分除去→選抜へ<br>(2 週間, 25 ℃, 16 h 日長)
 
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; 選抜1,2回目(カルス誘導)
 
; 選抜1,2回目(カルス誘導)
: カルス誘導培地:MS+2mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8%Agar
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: カルス誘導培地:MS+ 2 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+0.8 % Agar
 
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* サージカルテープでシール(選抜 1)。
 
* サージカルテープでシール(選抜 1)。
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; 選抜3回目(再分化誘導)
 
; 選抜3回目(再分化誘導)
: 再分化誘導培地 MS+1mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8%Agar
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: 再分化誘導培地 MS+ 1 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar
 
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* パラフィルムでシール。
 
* パラフィルムでシール。
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; 選抜4回目(シュート伸長・発根)
 
; 選抜4回目(シュート伸長・発根)
: シュート伸長・発根誘導培地:MS+1mg/lIBA+抗生物質+125mg/lCb+3% Suc+0.8%Agar
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: シュート伸長・発根誘導培地:MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
 
: カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
 
: カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
 
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; 選抜5回目(発根)
 
; 選抜5回目(発根)
: 発根誘導培地:MS+0.5mg/lIBA+抗生物質+125mg/lCb+3% Suc+0.8%Agar
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: 発根誘導培地:MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
 
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* シュートの条件:発根したカルスから取る。大きさ( 2cm程度。
 
* シュートの条件:発根したカルスから取る。大きさ( 2cm程度。
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* 根を傷つけない
 
* 根を傷つけない
* ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、1週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
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* ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
 
* 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
 
* 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
* 水やりは最初の2週間は水のみ、その後1000倍ハイポネックッス/週1。
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* 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。
  
 
===効率===
 
===効率===
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|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-022.png|200px]]
 
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; (平均インサート長:80Kb)
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; (平均インサート長:80 Kb)
 
: 1ベクターあたり
 
: 1ベクターあたり
:  感染:240切片
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:  感染:240 切片
:  馴化できた系統数: 0-21系統作出
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:  馴化できた系統数: 0-21 系統作出
 
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Revision as of 16:31, 8 July 2011

Contents

トマト遺伝子導入実験プロトコール

Horticulture-Solanum-lycopersicum-001.png

2005.6/27改正版

形質転換スケジュール

Horticulture-Solanum-lycopersicum-002.png
 トマト播種
 ↓
 シングルコロニーの培養
 ↓
 トマト前培養
 感染用アグロの培養
 ↓
 感染
 ↓
 除菌・選抜(1 回目)
 ↓
 以降 2 週間おきに選抜

実験プロトコール

滅菌

洗浄

クリーンベンチ作業

point
  • 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。

播種

クリーンベンチ作業

前培養

クリーンベンチ作業

作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように
胚軸は下の方を使う
子葉の両端を切る
→湿らしたろ紙へ一時置き→
MS+ 2 mg/l Zeatin+ 3 % Suc+0.8 % Agar
48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ)
パラフィルムでシール
→ 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養
point
  • 本葉が出たものはNG。
  • 作業中乾かないように注意!!
  • 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。

アグロバクテリウムの調整

 前培養;
 LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
 ↓2 日間 28 ℃,暗所
 
 感染用培養;
 シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
 ↓2 日間 28 ℃,暗所
 
point
  • 必ず増殖中(盛り上がる前)の菌プレートを用意する。
  • 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。

感染

注)改善の余地あり

除菌

注)改善の余地あり
 洗浄:MS液体培地
 除菌:MS液体培地+Cb 500 mg/l
point
  • 傷をつけないように気をつける。

選抜

Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png
選抜1,2回目(カルス誘導)
カルス誘導培地:MS+ 2 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+0.8 % Agar
point
  • サージカルテープでシール(選抜 1)。
  • パラフィルムでシール(選抜 2)。
  • 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
選抜3回目(再分化誘導)
再分化誘導培地 MS+ 1 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar
point
  • パラフィルムでシール。
  • 1シャーレあたり 20切片以下。
  • 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
Horticulture-Solanum-lycopersicum-019.png  
選抜4回目(シュート伸長・発根)
シュート伸長・発根誘導培地:MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
 
Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png  
選抜5回目(発根)
発根誘導培地:MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
point
  • シュートの条件:発根したカルスから取る。大きさ( 2cm程度。
  • 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。
  • アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。
  • 花芽は切り落とす!!

馴化

Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png
Horticulture-Solanum-lycopersicum-021.png
point
  • 根を傷つけない
  • ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
  • 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
  • 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。

効率

植物形質転換用バイナリーベクター
Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
Horticulture-Solanum-lycopersicum-022.png
(平均インサート長:80 Kb)
1ベクターあたり
 感染:240 切片
 馴化できた系統数: 0-21 系統作出
point
  • カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens
Personal tools

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