PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum
From Metabolomics.JP
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− | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-003.png|700 mg / 300 粒 | + | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-003.png|700 mg/300 粒 |
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-004.png|70 % EtOH 2 分振とう | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-004.png|70 % EtOH 2 分振とう | ||
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-005.png| | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-005.png| | ||
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<gallery perrow="3"> | <gallery perrow="3"> | ||
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-007.png|洗浄前 | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-007.png|洗浄前 | ||
− | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-008.png| | + | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-008.png|SDWで 1 分間× 5 回洗浄 |
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-009.png|洗浄後 | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-009.png|洗浄後 | ||
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− | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-010.png|1/ | + | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-010.png|1/2 MS+3 % Suc+ 0.8 % Agar pH 5.8 25 ℃, 16 h 日長で培養] |
− | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-011.png|50- | + | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-011.png|50-60 粒/7 cm <br>マヨネーズ瓶 |
− | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-012.png| | + | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-012.png|50 粒播種するとこんな感じ<br>→約 1 週間培養 |
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|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-013.png|150px|thumb|作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように<br>胚軸は下の方を使う<br>子葉の両端を切る]] | |[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-013.png|150px|thumb|作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように<br>胚軸は下の方を使う<br>子葉の両端を切る]] | ||
|→湿らしたろ紙へ一時置き→ | |→湿らしたろ紙へ一時置き→ | ||
− | |[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|150px|thumb|MS+ | + | |[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|150px|thumb|MS+ 2 mg/l Zeatin+ 3 % Suc+0.8 % Agar<br>48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ)<br>パラフィルムでシール<br>→ 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養]] |
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; 前培養; | ; 前培養; | ||
: LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク | : LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク | ||
− | : | + | : ↓2 日間 28 ℃,暗所 |
: | : | ||
; 感染用培養; | ; 感染用培養; | ||
: シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク | : シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク | ||
− | : | + | : ↓2 日間 28 ℃,暗所 |
: | : | ||
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− | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-015.png|菌液の準備;<br> | + | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-015.png|菌液の準備;<br>MS液体培地 50 ml +アセトシリンゴン(10 mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング |
− | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|切片を滅菌した茶漉しに入れ<br> | + | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|切片を滅菌した茶漉しに入れ<br>菌液内で 1 分間攪拌 |
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|滅菌したキムタオルで<br>水分除去 | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|滅菌したキムタオルで<br>水分除去 | ||
Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-018.png|さらに水分除去 | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-018.png|さらに水分除去 | ||
− | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|元の培地に<br> | + | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|元の培地に<br>(3 日間, 21 ℃,遮光) |
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;注)改善の余地あり | ;注)改善の余地あり | ||
: 洗浄:MS液体培地 | : 洗浄:MS液体培地 | ||
− | : 除菌:MS液体培地+ | + | : 除菌:MS液体培地+Cb 500 mg/l |
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− | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|2, | + | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|2,3 分ゆすりながら洗う<br>洗浄 1 回/除菌 1 回 |
− | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|水分除去→選抜へ<br>( | + | Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|水分除去→選抜へ<br>(2 週間, 25 ℃, 16 h 日長) |
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Line 117: | Line 117: | ||
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; 選抜1,2回目(カルス誘導) | ; 選抜1,2回目(カルス誘導) | ||
− | : カルス誘導培地:MS+ | + | : カルス誘導培地:MS+ 2 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+0.8 % Agar |
; point | ; point | ||
* サージカルテープでシール(選抜 1)。 | * サージカルテープでシール(選抜 1)。 | ||
Line 126: | Line 126: | ||
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; 選抜3回目(再分化誘導) | ; 選抜3回目(再分化誘導) | ||
− | : 再分化誘導培地 MS+ | + | : 再分化誘導培地 MS+ 1 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar |
; point | ; point | ||
* パラフィルムでシール。 | * パラフィルムでシール。 | ||
Line 135: | Line 135: | ||
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; 選抜4回目(シュート伸長・発根) | ; 選抜4回目(シュート伸長・発根) | ||
− | : シュート伸長・発根誘導培地:MS+ | + | : シュート伸長・発根誘導培地:MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar |
: カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す | : カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す | ||
: | : | ||
Line 142: | Line 142: | ||
| | | | ||
; 選抜5回目(発根) | ; 選抜5回目(発根) | ||
− | : 発根誘導培地:MS+0. | + | : 発根誘導培地:MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar |
; point | ; point | ||
* シュートの条件:発根したカルスから取る。大きさ( 2cm程度。 | * シュートの条件:発根したカルスから取る。大きさ( 2cm程度。 | ||
Line 160: | Line 160: | ||
; point | ; point | ||
* 根を傷つけない | * 根を傷つけない | ||
− | * | + | * ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。 |
* 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。 | * 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。 | ||
− | * | + | * 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。 |
===効率=== | ===効率=== | ||
Line 170: | Line 170: | ||
|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-022.png|200px]] | |[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-022.png|200px]] | ||
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− | ; ( | + | ; (平均インサート長:80 Kb) |
: 1ベクターあたり | : 1ベクターあたり | ||
− | : | + | : 感染:240 切片 |
− | : 馴化できた系統数: 0- | + | : 馴化できた系統数: 0-21 系統作出 |
|} | |} | ||
; point | ; point |
Revision as of 16:31, 8 July 2011
Contents |
トマト遺伝子導入実験プロトコール
2005.6/27改正版 |
形質転換スケジュール
|
実験プロトコール
滅菌
洗浄
クリーンベンチ作業
- point
- 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。
播種
クリーンベンチ作業
前培養
クリーンベンチ作業
→湿らしたろ紙へ一時置き→ |
- point
- 本葉が出たものはNG。
- 作業中乾かないように注意!!
- 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。
アグロバクテリウムの調整
- 前培養;
- LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
- ↓2 日間 28 ℃,暗所
- 感染用培養;
- シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
- ↓2 日間 28 ℃,暗所
- point
- 必ず増殖中(盛り上がる前)の菌プレートを用意する。
- 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。
感染
- 注)改善の余地あり
除菌
- 注)改善の余地あり
- 洗浄:MS液体培地
- 除菌:MS液体培地+Cb 500 mg/l
- point
- 傷をつけないように気をつける。
選抜
馴化
→ |
- point
- 根を傷つけない
- ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
- 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
- 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。
効率
- 植物形質転換用バイナリーベクター
- Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
|
- point
- カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
- Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
- Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens