PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum

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; 月曜日
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:(水)トマト播種
: シングルコロニーの培養
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:   ↓
: 除菌・選抜(1回目)
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:(月)シングルコロニーの培養
: ↓
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:   ↓
; 水曜日
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:(水)トマト前培養
: トマト播種
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:   感染用アグロの培養
: トマト前培養
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:   ↓
: 感染用アグロの培養
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:(金)感染
: ↓
+
:   ↓
; 金曜日
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:(月)除菌・選抜(1回目)
: 感染
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:   ↓
: ↓
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:   以降2週間おきに選抜
; 以降2週間おきに選抜
+
 
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Revision as of 18:39, 4 July 2011

Contents

トマト遺伝子導入実験プロトコール

200px

2005.6/27改正版


形質転換スケジュール

200px
(水)トマト播種
   ↓
(月)シングルコロニーの培養
   ↓
(水)トマト前培養
   感染用アグロの培養
   ↓
(金)感染
   ↓
(月)除菌・選抜(1回目)
   ↓
   以降2週間おきに選抜


実験プロトコール

滅菌


洗浄

クリーンベンチ作業

point
  • 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。


播種

クリーンベンチ作業


前培養

クリーンベンチ作業

File:トマト遺伝子導入実験プロトコール img 061.jpg
作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように
胚軸は下の方を使う
子葉の両端を切る
→湿らしたろ紙へ一時置き→
File:トマト遺伝子導入実験プロトコール img 062.jpg
MS+2mg/l Zeatin+3%Suc+0.8%Agar
48切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ)
パラフィルムでシール
→2日間,25℃,16h日長で培養
point
  • 本葉が出たものはNG。
  • 作業中乾かないように注意!!
  • 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。


アグロバクテリウムの調整

 前培養;
 LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
 ↓2日間 28℃,暗所
 
 感染用培養;
 シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
 ↓2日間 28℃,暗所
 
point
  • 必ず増殖中(盛り上がる前)の菌プレートを用意する。
  • 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。


感染

注)改善の余地あり


除菌

注)改善の余地あり
 洗浄:MS液体培地
 除菌:MS液体培地+Cb500mg/l
point
  • 傷をつけないように気をつける。


選抜

200px
選抜1,2回目(カルス誘導)
カルス誘導培地:MS+2mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8%Agar
point
  • サージカルテープでシール(選抜 1)。
  • パラフィルムでシール(選抜 2)。
  • 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
選抜3回目(再分化誘導)
再分化誘導培地 MS+1mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8%Agar
point
  • パラフィルムでシール。
  • 1シャーレあたり 20切片以下。
  • 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
200px  
選抜4回目(シュート伸長・発根)
シュート伸長・発根誘導培地:MS+1mg/lIBA+抗生物質+125mg/lCb+3% Suc+0.8%Agar
カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
 
200px  
選抜5回目(発根)
発根誘導培地:MS+0.5mg/lIBA+抗生物質+125mg/lCb+3% Suc+0.8%Agar
point
  • シュートの条件:発根したカルスから取る。大きさ( 2cm程度。
  • 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。
  • アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。
  • 花芽は切り落とす!!


馴化

point
  • 根を傷つけない
  • ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、1週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
  • 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
  • 水やりは最初の2週間は水のみ、その後1000倍ハイポネックッス/週1


効率

植物形質転換用バイナリーベクター
Liu et al. _Proc. Natl. Acad. Sci. USA. _96, 6535?6540, (1999)
200px
(平均インサート長:80Kb)
1ベクターあたり
  感染:240切片
  馴化できた系統数: 0-21系統作出
point
  • カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens
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