PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum

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Revision as of 17:41, 4 July 2011

Contents

トマト遺伝子導入実験プロトコール

200px

2005.6/27改正版


形質転換スケジュール

200px
 月曜日
 シングルコロニーの培養
 除菌・選抜(1回目)
 ↓
 水曜日
 トマト播種
 トマト前培養
 感染用アグロの培養
 ↓
 金曜日
 感染
 ↓
 以降2週間おきに選抜


実験プロトコール

滅菌


洗浄

クリーンベンチ作業

point
  • 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。


播種

クリーンベンチ作業


前培養

クリーンベンチ作業

File:トマト遺伝子導入実験プロトコール img 061.jpg
作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように
胚軸は下の方を使う
子葉の両端を切る
→湿らしたろ紙へ一時置き→
File:トマト遺伝子導入実験プロトコール img 062.jpg
MS+2mg/l Zeatin+3%Suc+0.8%Agar
48切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ)
パラフィルムでシール
→2日間,25℃,16h日長で培養
point
  • 本葉が出たものはNG。
  • 作業中乾かないように注意!
  • 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。


アグロバクテリウムの調整

 前培養;
 LBプレート(+抗生物質)にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
 ↓2日間 28℃,暗所
 
 感染用培養;
 シングルコロニーをLBプレート(+抗生物質)にストリーク
 ↓2日間 28℃,暗所
 
point
  • 必ず増殖中(盛り上がる前)の菌プレートを用意する。
  • 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。


感染

注)改善の余地あり


除菌

注)改善の余地あり
 洗浄:MS液体培地
 除菌:MS液体培地+Cb500mg/l
point
  • 傷をつけないように気をつける。


選抜

200px    
選抜1,2回目(カルス誘導)
カルス誘導培地:MS+2mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8%Agar
point
  • サージカルテープでシール(選抜 1)。
  • パラフィルムでシール(選抜 2)。
  • 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
Tochimoto-Peony-芍薬 P11 グラフ2.jpg    
選抜3回目(再分化誘導)
再分化誘導培地 MS+1mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8% Agar
point
  • パラフィルムでシール。
  • 1シャーレあたり 20切片以下。
  • 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
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