Aritalab:Lecture/Biochem/Proteomics
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| + | プロテオミクスでは、細胞からのタンパク質抽出物をトリプシン等プロテアーゼで処理し、数十から数百万のペプチド断片に分解します。これを網羅的に計測するためには通常、超低流速LCを用います。 | ||
| − | + | ==超低流速LC== | |
| − | + | ナノリットル程度の流速で分離することで単位時間あたり質量分析計に導入される試料の量を減らし、高濃度を達成できます。超低流速 LC-MS を用いると、数時間の測定で約 1000 個のタンパク質を同定できます。検出感度は一般的に f mol (10<sup>-15</sup>) レベル、質量計測の誤差は数十 ppm です。 | |
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| − | + | ===SRM, MRM=== | |
| − | + | SRM は Selected Reaction Monitoring, MRM は Multiple Reaction Monitoring の略でともに同じ概念です。 | |
| + | 三連四重極質量分析計において測定する質量範囲を狭め感度を高める手法です。 | ||
# 三つの四重極の一段目で、特定質量のペプチドだけを選択 | # 三つの四重極の一段目で、特定質量のペプチドだけを選択 | ||
# 二段目で、アルゴンガスと衝突させ、MS<sup>2</sup>フラグメントを生成 | # 二段目で、アルゴンガスと衝突させ、MS<sup>2</sup>フラグメントを生成 | ||
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これには、あらかじめ測定する質量値を入力しておきます。この処理を複数のターゲットに対しておこなう場合は MRM と呼ばれます。 | これには、あらかじめ測定する質量値を入力しておきます。この処理を複数のターゲットに対しておこなう場合は MRM と呼ばれます。 | ||
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UniProtKBデータベースによると、2 万タンパク質のうち 6 千タンパク質がリン酸化されています。これらのリン酸化タンパク質は、いくつかの手法で濃縮することができます。 | UniProtKBデータベースによると、2 万タンパク質のうち 6 千タンパク質がリン酸化されています。これらのリン酸化タンパク質は、いくつかの手法で濃縮することができます。 | ||
* 3 価の金属イオン (Fe<sup>3+</sup>, Ga<sup>3+</sup> など) を用いた固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography: IMAC) | * 3 価の金属イオン (Fe<sup>3+</sup>, Ga<sup>3+</sup> など) を用いた固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography: IMAC) | ||
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となるためにリン酸化タンパク質を効率よく濃縮できます。これを Hydroxy-Acid modified MOC = HAMMOC 法といいます。 | となるためにリン酸化タンパク質を効率よく濃縮できます。これを Hydroxy-Acid modified MOC = HAMMOC 法といいます。 | ||
| − | + | ===細胞表面タンパク質の測定=== | |
| + | いずれの方法でも 200 から 300 の表面タンパク質を捕捉し、量的変動を解析することが可能です。 | ||
| + | 細胞表面はウィルスや抗体が反応を起こす場になるため、発現量が一定以上あって外部刺激に応答する標的分子を探すことは抗体医薬の開発において重要です。とくにガンに対しては、抗体依存性細胞障害 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) を誘導してナチュラルキラー細胞にガン細胞を殺させる手法が注目されています。たとえば Her2 タンパク質は上皮増殖因子受容体ファミリーに属し、転移性乳癌で過剰発現する場合があります。そうしたレセプターが特定されれば、トラスツズマブ (Trastuzumab 商標名はハーセプチン) のような特異的抗体を設計してADCCを促進することでガン細胞を攻撃できます。 | ||
| − | + | ; ビオチンラベル法 | |
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# 培養細胞にビオチンを加えてラベルしたあと、超遠心機で膜画分をとってくる | # 培養細胞にビオチンを加えてラベルしたあと、超遠心機で膜画分をとってくる | ||
# トリプシンで処理した後にアビジンカラムで生成 | # トリプシンで処理した後にアビジンカラムで生成 | ||
# LC-MS解析すると、10<sup>8</sup> 程度の細胞から、200-300 のタンパク質を同定できる | # LC-MS解析すると、10<sup>8</sup> 程度の細胞から、200-300 のタンパク質を同定できる | ||
| − | ; | + | ビオチン試薬はペプチドのリジン側鎖（アミン）と反応してアミド結合を作ります。これを利用して細胞表面のタンパク質だけを濃縮できます。 |
| + | この方法ではケラチンなど細胞表面にあるか疑わしいペプチドも同定されます。 | ||
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| + | ;糖タンパク質捕捉法 | ||
| + | 細胞に酸化剤を入れて細胞表面の糖を開環させてしまいます。開環で生じるアルデヒドにヒドラジド (hydrazide) が共有結合できるので、これにビオチン化して濃縮する手法です。シアトルにあるシステムバイオロジー研究所のR Aebersold らが開発しました<ref>Zhang H, Li XJ, Martin DB, Aebersold R (2003) "Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry" Nat Biotechnol 21(6):660-6</ref>。 | ||
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| + | # 細胞を過ヨウ素酸で酸化すると ''cis''-ジオールの形を持つ糖部分が開環してアルデヒドになる | ||
| + | # ヒドラジド樹脂とアルデヒド部分を反応させ、固相に固定 | ||
| + | # ヒドラジド樹脂を洗浄 | ||
| + | # PNGase F など''N''-グリコシダーゼで処理して''N''型糖鎖のみを選択的に切断、回収 | ||
| + | # LC-MS で測定 | ||
===タンパク質の定量法=== | ===タンパク質の定量法=== | ||
| − | + | ;SILAC 相対定量法 | |
SILAC (Stable Isotope Labeling using Amino acids in Cell culture) は定量精度が高く実用的です。 | SILAC (Stable Isotope Labeling using Amino acids in Cell culture) は定量精度が高く実用的です。 | ||
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ただし、アルギニンが多いと生体内でプロリンに変換されるため、濃度を最適化することが重要。 | ただし、アルギニンが多いと生体内でプロリンに変換されるため、濃度を最適化することが重要。 | ||
| − | + | ;ICAT 化学標識法 | |
ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) は細胞を培養する必要がないため、動物組織や臨床検体にも使えます。 | ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) は細胞を培養する必要がないため、動物組織や臨床検体にも使えます。 | ||
Revision as of 16:50, 8 June 2011
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Proteomics
プロテオミクスでは、細胞からのタンパク質抽出物をトリプシン等プロテアーゼで処理し、数十から数百万のペプチド断片に分解します。これを網羅的に計測するためには通常、超低流速LCを用います。
超低流速LC
ナノリットル程度の流速で分離することで単位時間あたり質量分析計に導入される試料の量を減らし、高濃度を達成できます。超低流速 LC-MS を用いると、数時間の測定で約 1000 個のタンパク質を同定できます。検出感度は一般的に f mol (10-15) レベル、質量計測の誤差は数十 ppm です。
| Type | Characterstics | Advantages | Usage |
|---|---|---|---|
| QQQ 三連四重極 |
High speed | 測定質量を絞ると更に高感度 | SRM 用 |
| IT イオントラップ |
High sensitivity | MSnが可能 | 同定用 |
| Q-TOF 四重極-飛行時間型 |
High accuracy | バランスが良い | 同定、定量用 |
| Orbitrap (IT-FT) |
High accuracy & sensitivity | 検出器を二つ持つ | 同定、定量用 |
タンパク質の測定
SRM, MRM
SRM は Selected Reaction Monitoring, MRM は Multiple Reaction Monitoring の略でともに同じ概念です。 三連四重極質量分析計において測定する質量範囲を狭め感度を高める手法です。
- 三つの四重極の一段目で、特定質量のペプチドだけを選択
- 二段目で、アルゴンガスと衝突させ、MS2フラグメントを生成
- 三段目で特定の断片化ペプチドだけを選択
これには、あらかじめ測定する質量値を入力しておきます。この処理を複数のターゲットに対しておこなう場合は MRM と呼ばれます。
リン酸化タンパク質の測定
UniProtKBデータベースによると、2 万タンパク質のうち 6 千タンパク質がリン酸化されています。これらのリン酸化タンパク質は、いくつかの手法で濃縮することができます。
- 3 価の金属イオン (Fe3+, Ga3+ など) を用いた固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography: IMAC)
- ただし金属イオンはペプチド表面にあるヒスチジンも捕らえるため、目標タンパク質の網羅性は下がります。
- 酸化金属 (TiO2, ZrO2, Al2O3) などを用いた酸化金属クロマトグラフィー (MOC)
さらに、カラムと溶媒の両方にヒドロキシ酸[1]を加えておくと、MOCの結合強度が
酸性タンパク質 < ヒドロキシ酸 < リン酸基
となるためにリン酸化タンパク質を効率よく濃縮できます。これを Hydroxy-Acid modified MOC = HAMMOC 法といいます。
細胞表面タンパク質の測定
いずれの方法でも 200 から 300 の表面タンパク質を捕捉し、量的変動を解析することが可能です。 細胞表面はウィルスや抗体が反応を起こす場になるため、発現量が一定以上あって外部刺激に応答する標的分子を探すことは抗体医薬の開発において重要です。とくにガンに対しては、抗体依存性細胞障害 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) を誘導してナチュラルキラー細胞にガン細胞を殺させる手法が注目されています。たとえば Her2 タンパク質は上皮増殖因子受容体ファミリーに属し、転移性乳癌で過剰発現する場合があります。そうしたレセプターが特定されれば、トラスツズマブ (Trastuzumab 商標名はハーセプチン) のような特異的抗体を設計してADCCを促進することでガン細胞を攻撃できます。
- ビオチンラベル法
- 培養細胞にビオチンを加えてラベルしたあと、超遠心機で膜画分をとってくる
- トリプシンで処理した後にアビジンカラムで生成
- LC-MS解析すると、108 程度の細胞から、200-300 のタンパク質を同定できる
ビオチン試薬はペプチドのリジン側鎖（アミン）と反応してアミド結合を作ります。これを利用して細胞表面のタンパク質だけを濃縮できます。 この方法ではケラチンなど細胞表面にあるか疑わしいペプチドも同定されます。
- 糖タンパク質捕捉法
細胞に酸化剤を入れて細胞表面の糖を開環させてしまいます。開環で生じるアルデヒドにヒドラジド (hydrazide) が共有結合できるので、これにビオチン化して濃縮する手法です。シアトルにあるシステムバイオロジー研究所のR Aebersold らが開発しました[2]。
- 細胞を過ヨウ素酸で酸化すると cis-ジオールの形を持つ糖部分が開環してアルデヒドになる
- ヒドラジド樹脂とアルデヒド部分を反応させ、固相に固定
- ヒドラジド樹脂を洗浄
- PNGase F などN-グリコシダーゼで処理してN型糖鎖のみを選択的に切断、回収
- LC-MS で測定
タンパク質の定量法
- SILAC 相対定量法
SILAC (Stable Isotope Labeling using Amino acids in Cell culture) は定量精度が高く実用的です。
- 標識したい細胞培地に 13C ラベルしたアルギニン、リジンを入れる
- 抽出したタンパク質を、通常の培地で培養した細胞由来のタンパク質と混ぜる
- トリプシンで処理し、LC-MS で測定
ただし、アルギニンが多いと生体内でプロリンに変換されるため、濃度を最適化することが重要。
- ICAT 化学標識法
ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) は細胞を培養する必要がないため、動物組織や臨床検体にも使えます。
- 別々の試料からタンパク質（ペプチド）をそれぞれ抽出する
- 片方には同位体標識をした化合物、もう片方には標識していない化合物を結合させる
- 混合してトリプシン処理したものを、LC-MS で測定
バリアントが考案されています。
- iTRAQ 法
レポーター、バランサー、アミノ酸反応基を含み、質量の総計が同じになるように設計された iTRAQ試薬 4 種を使って標識します。
- <L+3>− < R >− peptide
- <L+2>− <R+1>− peptide
- <L+1>− <R+2>− peptide
- < L >− <R+3>− peptide
4つのサンプルを標識後に混ぜて比較すると、MS解析では全てのラベルしたペプチドが単一のピークとして検出されますが、MS/MS解析をすると<A>から<A+3>までのレポーターイオンが観測され、定量データが得られます。ただし酵素消化後や濃縮をした後に標識するのが一般的で、精度は下がらざるをえない。
- 文献、参考
